小鼠黑色素瘤高轉(zhuǎn)移細(xì)胞 , B16F10細(xì)胞5×10^5以上/1ml
對(duì)于大多數(shù)細(xì)胞研究工作者來(lái)說(shuō)，小鼠黑色素瘤高轉(zhuǎn)移細(xì)胞 , B16F10細(xì)胞污染那可是個(gè)糟糕的事情，也是比較容易出現(xiàn)的情況，我們?nèi)绾畏婪叮绾伪苊?，是我們要學(xué)習(xí)和掌握的。
Isopropyl-b-D-thiogalactoside 5 g
PREMIX 10XTBE BUF/WAS 100957 4 4 l
Pyruvate Kinase （PK）, susp., 1 100 mg （10 ml）
DNase I recombinant, RNase-fre 10,000 U （provided with incubation buffer）
小鼠黑色素瘤高轉(zhuǎn)移細(xì)胞 , B16F10細(xì)胞GPT, 25 mg 25 mg （2.5 ml）
Expand Long Templ.PCR Syst. 150 U
Proteinase K,recomb.,PCR Grd.S 1.25 ml
Pyrophosphatase, Inorganic （PP 1 mg （1 ml）
Ascorbate Oxidase Spatula 25 spatulas
Lysozyme 10 g 
 下面我們對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)中常見(jiàn)的污染情況，做個(gè)總結(jié)：
1）原蟲：培養(yǎng)液可輕微渾濁，顯微鏡下那些細(xì)小的點(diǎn)狀物數(shù)量非常多，輕微活動(dòng)，細(xì)胞雖然可以生長(zhǎng)但繁殖速度卻明顯減慢，而且細(xì)胞狀態(tài)不好，邊緣不清楚，細(xì)胞不透亮。他們與細(xì)胞可共生但會(huì)與細(xì)胞爭(zhēng)奪營(yíng)養(yǎng)。這種共生是非常普遍的，但他們的數(shù)量小，細(xì)胞站優(yōu)勢(shì)所以不會(huì)影響到細(xì)胞的正常生長(zhǎng)，只有當(dāng)他們到達(dá)一定的數(shù)量時(shí)就會(huì)影響到細(xì)胞的生長(zhǎng)，zui終形成惡性循環(huán)。
2）霉菌：培養(yǎng)液是清亮的，倒置顯微鏡下無(wú)雜質(zhì)，37度孵箱培養(yǎng)2-3天，仍清亮，但出現(xiàn)絮狀雜質(zhì)，鏡下可見(jiàn)呈細(xì)絲狀的團(tuán)狀漂浮物，可看到明顯的菌絲，細(xì)胞仍可生長(zhǎng)，但時(shí)間長(zhǎng)之后，細(xì)胞的活力狀態(tài)變差，用硫酸銅溶液擦拭CO2孵箱內(nèi)，再把水盤里也加上飽和量的硫酸銅。或者在培養(yǎng)箱的托盤加入飽和的消毒*高鹽液體,可以防止霉菌污染。CO2孵箱被霉菌污染后，可把所有細(xì)胞暫時(shí)轉(zhuǎn)移，采用過(guò)氧乙酸擦洗孵箱（包括隔板，箱壁）。并把過(guò)氧乙酸放置在孵箱內(nèi)一個(gè)小時(shí)，使其蒸汽彌漫。待過(guò)氧乙酸的氣味消散后，再移入細(xì)胞。孵箱應(yīng)定期清潔（2月左右），尤其在多雨的季節(jié)。其它培養(yǎng)箱清洗方法是：用84液擦洗－清水擦洗－75%酒精擦洗－紫外燈照。預(yù)防霉菌污染，可在培養(yǎng)基里加3u/ml的兩性霉素或*或*或雙抗；但細(xì)胞一旦污染，很難挽救，*或*或雙抗都于事無(wú)補(bǔ)，建議舍棄該污染細(xì)胞。，將環(huán)境*消毒，如果所有細(xì)胞都污染，可能是系統(tǒng)污染，檢查一下培養(yǎng)基和器材，如果只是個(gè)別污染，可能是操作問(wèn)題，就要注意操作。
3）細(xì)菌：細(xì)菌在普通倒置顯微鏡下為黑色細(xì)沙狀，根據(jù)感染細(xì)菌的不同，可有不同的外形，培養(yǎng)液一般會(huì)渾濁變黃，對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)影響明顯。仔細(xì)檢查一下器皿的滅菌情況，是否在高壓滅菌時(shí)放氣時(shí)間足夠，壓力足夠！尤其是和儲(chǔ)存培養(yǎng)液接觸的移液管等物品，連續(xù)兩次污染的話有可能造成儲(chǔ)存液污染，一定要注意！下次使用前檢查一下培養(yǎng)液是否存在渾濁的現(xiàn)象！ 可在培養(yǎng)液中加相應(yīng)的抗生素處理
4）黑蛟蟲：可以穿透濾膜，也可以通過(guò)空氣傳播，低倍下為黑色點(diǎn)狀，高倍下可看見(jiàn)黑色的小蟲游來(lái)游去，培養(yǎng)液也是不渾的，一般不會(huì)太影響，細(xì)胞還是可以用的。常常是細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好，且觀測(cè)到的運(yùn)動(dòng)物無(wú)明顯增多，且培養(yǎng)液顏色、透明度無(wú)明顯變化，可在同一批號(hào)的血清養(yǎng)的細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)類似現(xiàn)象。對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)不會(huì)有明顯影響，在細(xì)胞增殖旺盛之后會(huì)自然消失，除更換血清外無(wú)須特殊處理。建議如果細(xì)胞有可能是此種污染的話，可以增加細(xì)胞的種板密度，以提高細(xì)胞的生存率。
5）真菌：一般培養(yǎng)液清亮，不變色，鏡下有絲狀物，有些真菌開(kāi)始很像死細(xì)胞碎片，只是它很多很多的小塊很清楚，象珊瑚狀，不象細(xì)胞碎片分不清，慢慢的會(huì)長(zhǎng)出很細(xì)的黑色絲狀物。真菌生長(zhǎng)的比較慢，不象細(xì)菌那么容易被發(fā)現(xiàn)，但是一旦發(fā)現(xiàn)有它的存在細(xì)胞就被污染了，也很難救活了。
6）支原體：黑色的，好象多為多形，培養(yǎng)液一般培養(yǎng)液一般會(huì)渾濁，原體感染，國(guó)內(nèi)血清很多都沒(méi)有做支原體陰性檢測(cè)，而支原體是牛血清中zui常見(jiàn)的微生物之一。而且它不能用過(guò)濾的辦法除去。支原體感染細(xì)胞以后，細(xì)胞病變不很明顯，只是慢慢死去。用泰樂(lè)菌素，獸用支原體病的藥，但可用于細(xì)胞培養(yǎng)，無(wú)任何不良反應(yīng)。Sigma公司的使用時(shí)用50ug/ml Tylosin培養(yǎng)液培養(yǎng)6天或連續(xù)傳兩代即可清除支原體污染。如果作為常用的抗生素的話, 建議用8ug/ml的濃度。
污染的可能原因：可能原因很多比如配液消毒問(wèn)題、操作問(wèn)題、環(huán)境問(wèn)題等等關(guān)于培養(yǎng)基的無(wú)菌狀況，取培養(yǎng)基至培養(yǎng)瓶中（不加細(xì)胞），37度試培養(yǎng)一段時(shí)間后觀察。如果沒(méi)有細(xì)菌生長(zhǎng)就是操作的問(wèn)題。 也可以在培養(yǎng)基中事先加入雙抗（*和氨芐*）。但雙抗有時(shí)會(huì)影響細(xì)胞的狀態(tài)，所以在做轉(zhuǎn)染、檢測(cè)細(xì)胞某項(xiàng)指標(biāo)前一定要撤去雙抗，以避免影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。1、孵箱應(yīng)定期用三氧機(jī)消毒或者 紫外光照射，并用酒精和新潔爾滅試擦孵箱同時(shí)孵箱內(nèi)的水應(yīng)是三蒸水2、超凈臺(tái)\取材\器材\培養(yǎng)液\培養(yǎng)瓶\操作等因素3、超凈臺(tái)的風(fēng)機(jī)不能過(guò)大，風(fēng)機(jī)到6-8格。否則也可能能致霉菌污染4、無(wú)菌室經(jīng)甲醛熏蒸消毒后，可用同等量的氨水噴灑中和，約幾小時(shí)即可進(jìn)入操作。
Aldehyde Dehydrogenase from Ye 250 U
NADPH, approx. 98%, 500 mg 500 mg
Proteinase K,recomb.,PCR Grd.l 2 x 250 mg
Streptavidin Magnetic Particle 10 ml
Amyloglucosidase from Aspergil 100 mg （10 ml）
mRNA Capture Kit 1 kit （192 reactions）
FastStart Taq DNA Pol. dNTPack 1,000 U （4 x 250 U）
NADP, approx. 98%, 1 g 1 g
Pwo SuperYield DNA Polymerase 500 U （2 x 250 U）
Chromozym t-PA 20 mg
X-gal, 2.5g 2.5 g
Buffers in a Box, premix PBS B 4 l
Glucose-6-phosphate 5 g
NAD, approx. , Grade I, ly 5 g
Glutamate Dehydrogenase （GlDH） 3,000 U
Rapid DNA Ligation Kit 1 kit （40 DNA ligation reactions）
Free Fatty Acids, Half Micro T approx. 5 x 10 tests
tRNA, from E.coli MRE 600, 100 100 mg
NAD, approx. 98%, lyo., 10 g 10 g
PCR Dig Probe Synthesis 1pc 1 kit （25 reactions）
ddNTP Set, Sequencing Grade 4 x 1 µmol （4 x 100 µl）
L-MDH, （pig heart）, 25 mg 25 mg （5 ml）
G6P-DH, Grade II, 25 mg 25 mg （5 ml）
FastStart Taq DNA Polymerase, 1,000 U （4 x 250 U）
ADH, susp. 1g （34ml） 1 g （34 ml）
Formate Dehydrogenase, 250 u 250 U
PCR Master 1 kit （for 200 PCR reactions of 50 µl final reaction volume）