構(gòu)建好噬菌體展示文庫后,可以通過連續(xù)的幾輪親和篩選,快速地分離出具有新的核酸結(jié)合特性的多肽異變體。這可以很方便地通過如下方法得以實(shí)現(xiàn):針對固定在鏈親和素(streptavidin)包被的基質(zhì)上的、合成的*標(biāo)記的DNA或RNA靶標(biāo),對文庫進(jìn)行鑒定。未結(jié)合的克隆被洗滌下來,而篩選出的克隆則被保留、洗脫,然后通過一個(gè)細(xì)菌宿主進(jìn)行擴(kuò)增。通過改變結(jié)合及洗滌的條件,可以產(chǎn)生具有不同親和性的一系列多肽。此外,可溶性DNA(或RNA)競爭劑的使用,可以使對具有預(yù)定結(jié)合特性的變異體的篩選,針對某一個(gè)序列而不是另外一個(gè)。
● *連接的DNA或RNA寡核苷酸靶標(biāo)
● DNA退火緩沖液(2X儲液):40mmol/L Tris—HCl,200 mmol/LNaCl,pH 8.0
● RNA折疊緩沖液(1XCM):50mmol/L二甲身酸銨(ammonium cacodylate),2mmol/LMgCl2,pH 6.5
● 2XTY培養(yǎng)基
● 四環(huán)素
● 鏈親和素包被的免疫管(或微孔板)(Roche Molecular Biochemicals)
● 磷酸鹽緩沖液(PBS)(10X儲液):80g/L NaCl,2g/L KCl,11.5g/L Na2HP04·7H20,2g/LKH2P04
● 1mol/L ZnCl2(用于鋅指結(jié)構(gòu)域文庫的篩選)
● 凍干的脫脂牛奶(Marvel;Premier Brands UK Ltd.)
● Tween-20
● 10mg/ml超聲破碎的鮭魚精(salmon sperm)DNA
● 0.1mol/L三乙醇胺(triethanolamine)
● lmol/L Tris—HCl,pH 7.4
● 大腸桿菌F’菌株,如TGI
● M9小化瓊脂培養(yǎng)基:6.0g/LNa2HP04,3.0g/LK2HP04,L0g/LNh4cl,0.5g/L NaCl;高壓滅菌后加入:1.0ml/L的lmol/L MgS04, 2.0g/L 的葡萄糖,0.1ml/L的lmol/L CaCl2,1.0ml/L的1mol/L硫a-HCl,15.0g/L瓊脂
● TYE瓊脂培養(yǎng)基
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