在有偶合劑（coupling reagent）HATU（Sigma）和DMF（Sigma）的情況下，加入異硫氰酸熒光素I （fluorescein isothiocyanate isomer 1） （Sigma）或若丹明B（Sigma），我們以此作為多肽固相合成的后一步，以N端標(biāo)記了異硫氰酸熒光素（FITC）或若丹明的偶聯(lián)體的形式合成篩選出多肽。

我們通常用100ul的lmmol/L多肽PBS溶液注射一只鼠；然而佳濃度必須要經(jīng)驗(yàn)性地測(cè)定。例如，lmmol/L1000Da的多肽溶液是lmg/ml，而注射lOOul此溶液是總共100ug或lOOnmol的多肽。每只鼠大約有2ml的循環(huán)血液，因此得到的多肽濃度是100nmol/2m1或50umol/L，在這些多肽預(yù)期的親和性常數(shù)范圍之內(nèi)。

對(duì)這些實(shí)驗(yàn)的對(duì)照多肽是熒光標(biāo)記的點(diǎn)突變多肽或一個(gè)多肽的失真譯本?？商娲兀粋€(gè)合適的對(duì)照是一段FITC或若丹明標(biāo)記的NSSSVDK多肽：通過(guò)非重組T7Select415噬菌體展示的序列。

熒光標(biāo)記能使多肽疏水性更強(qiáng)并難以直接溶解于水中。如果是這樣，將多肽加入少量的100％DMSO溶液中（如：100mg/ml），然后緩慢加入1XPBS或MilliQ水，直到多肽濃度為1mg/ml；也可以通過(guò)使用較低的多肽濃度、適度的加熱、超聲波降解及攪拌來(lái)提高溶解性。在相同條件下制備對(duì)照多肽。為了在不需要額外的抗體染色的情況下使血管顯現(xiàn)，我們注射FITC標(biāo)記的（對(duì)于若丹明多肽）或*連接的番茄凝集素（tomatolectin），并以Streptavidin-Alexa Fluor 594作為次級(jí)反應(yīng)物（對(duì)于FITC標(biāo)記的多肽）。