成功的初級(jí)庫篩選將會(huì)得到一個(gè)或更多的能與受體特異性結(jié)合的肽段。這些分離得到的肽段的親和性一般為比較低的微摩爾級(jí)別，從而不能在基于細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)下檢測(cè)到信號(hào)。為了提高這些初始篩選到的肽段的親和性，可以通過低價(jià)展示系統(tǒng)構(gòu)建含有大量變異體的突變庫。然后通過一系列的能獲取高親和力肽的方法來篩選這些庫。

序列的突變可以通過很多的寡核苷酸合成策略達(dá)到。其中一種很典型的策略是使用70％的原始?jí)A基和分別為10％的其余堿基的亞磷酰胺混合物合成密碼子前兩位，然后用等物質(zhì)的量的G和T合成第三位。這種70；10：10：10的策略能夠使序列靶點(diǎn)產(chǎn)生約50％的突變。突變率可以通過增加或減少原始和變異堿基的比例來調(diào)節(jié)。選擇恰當(dāng)?shù)暮?jiǎn)并密碼子模式也可以合成一系列的氨基酸。例如，需要檢查某個(gè)位置半*是否必要，就可以合成編碼為TST的序列，其中S代表等物質(zhì)的量的G和C的混合物。這個(gè)簡(jiǎn)并密碼子將會(huì)編碼50：50比例混合的*和半*。一個(gè)序列中可以固定一些保守的氨基酸，而改變其兩側(cè)的氨基酸殘基。額外的隨機(jī)氨基酸殘基也可以通過加入NNK密碼子的方式加到肽段兩端。以上這些策略在構(gòu)建次級(jí)庫的時(shí)候通常是聯(lián)合使用的，以使其不同肽的數(shù)量與初級(jí)庫隨機(jī)肽的數(shù)量盡可能相同。

次級(jí)庫篩選的難點(diǎn)在于從大量的變異體中篩選出與受體結(jié)合的親和性有提高的克隆。使用低價(jià)展示系統(tǒng)可以降低篩選得到與固化受體有多價(jià)結(jié)合作用的噬菌體的可能性。我們實(shí)驗(yàn)室使用與pⅧ噬菌粒庫相似的pⅢ噬菌粒庫來實(shí)現(xiàn)這個(gè)目的。下文中所描述的冠狀二聚體系統(tǒng)在發(fā)現(xiàn)高親和力肽段中被證明更為有效。

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