（1）樣品洗畢，重懸于含1％正常羊IgG的PBS中。在1．5m1錐形管中胚胎或其他樣品所占體積應(yīng)少于50fJl，或在5mlsnap-top管中應(yīng)少于200fil。搖動孵育1h。
在此方法中，以非免疫動物的羊IgG作為封閉劑，即從正常羊血清中通過蛋白G純化制備。因本文推薦的標(biāo)記二抗是羊抗鼠（或兔）免疫球蛋白抗體，故選擇羊IgG作為封閉試劑。如使用的是另一來源的標(biāo)記二級試劑，則應(yīng)改用其他封閉劑，如可選用3％牛血清白蛋白。
（2）用PBS洗樣品2次。
（3）加一抗：用含蛋白質(zhì)的溶液進(jìn)行抗體稀釋。例如，用含1％正常羊IgG的PBS。
單克隆抗體選用雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清（特異性抗體濃度為20-50us／mi；以1：10稀釋度作起點為佳）。小鼠腹水，純化的單克隆抗體和多克隆抗體以及粗制的多克隆抗血清應(yīng)測試一定范圍內(nèi)的稀釋度，從而使特異性抗體濃度達(dá)到o．01～1Ps／ml。如果特異性抗體濃度是未知的，制備并測試初始制品的不同稀釋度（1：10，1：100，1：1000和1：10 000）。
在果蠅類標(biāo)本的抗原分析中常使用雙標(biāo)記方法，詳見第五章。異硫氰酸熒光素（FITC）和德克薩斯紅（Texas red）是一對很好的試劑，由于FITC標(biāo)記抗體所發(fā)出的熒光更強(qiáng)，因而可用來染色較難檢測的抗原。
（4）在4℃孵育樣品24h。
（5）用PBS洗樣品3次，每次5min以上。該緩沖液中可含1％TritonX—100或NP-40，以降低背景。
（6）加熒光染料標(biāo)記的二抗試劑：用含蛋白質(zhì)的溶液如1％正常羊IgG／PBS制備各種稀釋度。常用的二抗試劑包括抗免疫球蛋白抗體、蛋白A和蛋白G。一般而言，建議使用辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠（或兔）免疫球蛋白二抗。標(biāo)記的二抗可以購自供應(yīng)商，如果使用商業(yè)來源的標(biāo)記二級試劑，其稀釋度可從1：50至1：1000。堿性磷酸酶標(biāo)記的試劑應(yīng)用Tris緩沖液稀釋，而不用PBS。
（7）與標(biāo)記的二抗試劑在4℃孵育至少1h。
（8）用PBS洗樣品3次，每次5min。該緩沖液中可以含1％TritonX-100或NP-40，以降低背景。
（9）優(yōu)化選擇：當(dāng)在高倍鏡下觀察胚胎時，胚胎的直觀視覺模式和通過胚胎的光路長度常引起樣品出現(xiàn)不透明的現(xiàn)象。為了克服這一特點，通常用不同的試劑處理胚胎，這樣可改變胚胎的折射指數(shù)。可將胚胎在甘油或甲基水楊酸鹽溶液中孵育。對于大多數(shù)染色標(biāo)本而言，甘油效果較好。
將胚胎重懸于500u1的甘油／PBS（50：50）混合液中，于室溫下孵育1h。
離心胚胎，重懸于70：30的甘油／PBS混合液中。
經(jīng)過甲基水楊酸鹽溶液處理的標(biāo)本清晰度比甘油更好，但其易揮發(fā)，使一些工作者難于忍受這種氣味。此外，它沒有黏度，使得對胚胎的處理容易。可先將胚胎通過一系列乙醇處理：50％乙醇5min，70％乙醇5 min，90％乙醇5 min，100％乙醇5 min，各2次。加500~1甲基水楊酸鹽溶液，作用10 mm，不要搖動試管。胚胎將沉到底部。去除上清并加新鮮的甲基水楊酸鹽溶液。后用甘油代替甲基水楊酸鹽溶液。
（10）使用共聚焦顯微鏡觀察并記錄圖像。為了正確使用該儀器，工作者應(yīng)參考這一特殊儀器的使用說明。關(guān)于共聚焦顯微鏡的一般性討論，參見Spector等（1998）。
