G蛋白偶聯(lián)受體（G-protein-coupled receptors，GPCR）是高等真核生物中廣泛存在的感知和傳感實體，在細胞信號傳導以及免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮著重要作用。通過利用GPCR的顯著傳感能力以及真核微生物釀酒酵母的遺傳特性來構建生物傳感器可用于化學物質(zhì)、細菌、病毒和疾病的檢測，并且因其成本和便攜等特性，可應用到多種不同釀酒酵母生物傳感器開發(fā)中。然而對于生物傳感器的性能而言，靈敏且可靠的輸出至關重要，尤其是對于目標分析物可能以痕量濃度存在的低成本應用。因此，迫切需要一種廣泛適用的策略來提高基于酵母GPCR的生物傳感器的檢測限和信號輸出，以滿足實際使用的要求

近日，廈門大學袁吉鋒教授團隊在Biosensors and Bioelectronics雜志上發(fā)表了一篇題為“Cascaded amplifying circuit enables sensitive detection of fungal pathogens"的研究論文。該論文在釀酒酵母中將GPCR信號通路與半乳糖調(diào)節(jié) (GAL) 系統(tǒng)耦合，并實施正反饋環(huán)路以增強酵母生物傳感器在真菌檢測方面的性能。證明了級聯(lián)放大電路可以顯著改善工程化酵母生物傳感器，具有更好的靈敏度和信號輸出幅度，這將為它們在公共衛(wèi)生領域的實際應用鋪平道路。

研究人員前期在釀酒酵母中利用GPCR 信號級聯(lián)來重塑具有不同表達譜的酵母半乳糖調(diào)節(jié)子，展示了基于GPCR系統(tǒng)的可塑遺傳裝置可能為未來的代謝工程和生物傳感器應用帶來巨大的希望。而GPCR系統(tǒng)在細胞信號轉(zhuǎn)導中發(fā)揮著至關重要的作用，已被廣泛用作酵母的傳感元件生物傳感器開發(fā)。因此研究人員在前期研究基礎上通過人工轉(zhuǎn)錄因子（synthetic transcription factor，sTF）將GPCR信號通路與半乳糖調(diào)節(jié)（GAL）系統(tǒng)連接起來（Cell Reports Methods, 2023, 3, 100647），引入了正反饋回路進一步增強酵母傳感器的性能，從而開發(fā)模塊化酵母生物傳感器，可低成本、靈敏且快速地檢測病原真菌。

首先，GPCR信號機制本質(zhì)上是可模塊化的，研究人員基于前期工作半乳糖調(diào)節(jié) (GAL) 系統(tǒng)通過人工轉(zhuǎn)錄因子與信息素感知的 GPCR 信號通路耦合，重塑了MAPK控制的轉(zhuǎn)錄因子，將輸出模塊重定位為半乳糖系統(tǒng)。通過使用來自病原真菌白色念珠菌的異源GPCR取代酵母天然Ste2受體調(diào)整GPCR蛋白的輸入模塊，重構的酵母生物傳感器可感知來自病原真菌的外來信息素并觸發(fā)信號轉(zhuǎn)導以誘導GAL系統(tǒng)下報告基因的表達（圖1）。

級聯(lián)放大在傳感器設計中可實現(xiàn)感知信號放大以及輸出信號的增強，因此研究人員在工程化酵母生物傳感器中引入一個額外的正反饋回路來增強靈敏度和信號輸出。具體的是，設計了一種正反饋放大器，即可自響應的GAL系統(tǒng)控制下的Gal4表達盒組成（圖2）。感知真菌信息素后，傳感器系統(tǒng)除了控制報告基因的sTF之外，還包含額外的轉(zhuǎn)錄放大層，sTF 驅(qū)動Gal4轉(zhuǎn)錄激活劑的轉(zhuǎn)錄，從而進一步放大源自sTF的信號，以提高生物傳感器的靈敏度和輸出幅度。為了評估級聯(lián)放大生物傳感器的性能，使用不同梯度濃度的病原真菌白色念珠菌的信息素對其進行了測試，在同步敲除釀酒酵母GPCR系統(tǒng)的負反饋因子Sst2之后，級聯(lián)放大生物傳感器可具備靈敏的檢測性能，相比于初始傳感器，檢測限（LOD）提升了4000倍（從1 nM提升至0.25 pM），半有效濃度（EC50）提升了9700倍（從32.55 nM到3.323 pM）（圖3），此外，信號級聯(lián)的設計延長了劑量持續(xù)時間，即使在低劑量的信息素刺激下也能產(chǎn)生持續(xù)且顯著的信號輸出。且利用傳感器信號感知-信號輸出關系可進行信息素的定量分析。

此外，為了進一步確定傳感器的性能，研究人員還嘗試探究溫度、pH以及迭代培養(yǎng)對傳感器的性能影響，結(jié)果表明，基于GPCR的釀酒酵母傳感器具有明顯的穩(wěn)定性以及精確性（圖3）同時為了滿足未來的傳感器實際應用，研究人員采用比色測定而不是依賴熒光信號來設計視覺輸出模塊，結(jié)果表明工程化酵母生物傳感器可以通過信號級聯(lián)放大來檢測真菌信息素，并產(chǎn)生肉眼可以捕獲的強烈信號輸出。

總之，這項研究成功地利用酵母中的級聯(lián)信號放大器來增強生物傳感器在檢測限、動態(tài)范圍和輸出幅度方面的性能。級聯(lián)信號放大使工程化酵母生物傳感器能夠在病原體檢測中提供更好的靈敏度和良好的可靠性。未來信號受體通過多個級聯(lián)信號放大的信號轉(zhuǎn)導和信號輸出模塊的組合優(yōu)化將最終實現(xiàn)眾多具有實際應用價值的生物傳感器開發(fā)。

來源：傳感器專家網(wǎng)