CarboMAX 是一種創(chuàng)新的專禾刂偶聯(lián)技術(shù)，專為高溫下的肽鏈合成而設(shè)計。該技術(shù)相較于現(xiàn)行的碳二亞胺方法，提供了更快的反應(yīng)激活速度，和減少相應(yīng)的外消旋化，從而顯著提升了合成效率。此外，CarboMAX 在高溫條件下增強了對酸敏感連接物的穩(wěn)定性，特別對于磷酸肽、糖肽的合成，以及在超酸敏感鏈接劑上進行肽鏈合成時，這一特性尤其有利。
02 引言 Introduction
近期研究表明，在 90°C 的條件下，利用高效固相肽合成過程（HE-SPPS）進行的原位碳二亞胺激活可以實現(xiàn)快速且高效的肽偶聯(lián)。HE-SPPS 避免了使用基于季銨鹽的方法（例如 HCTU 和 HATU）時所需的大量強堿，從而減少了顯著的外消旋化問題（特別是對于半胱氨酉夋），以及由于d-內(nèi)酰胺形成而導(dǎo)致的精氨酉夋缺失。CarboMAX 偶聯(lián)方法通過對現(xiàn)有碳二亞胺方法的兩個主要改進，進一步提升了合成效果：
(i) 提升粗制品純度與減少外消旋化：
CarboMAX 通過提高相對于氨基酸的碳二亞胺用量（2當量），加速了必要的O-?；愲寮せ钪虚g體的形成，這一過程在碳二亞胺激活中通常較為緩慢。O-?；愲逍纬傻乃俾试黾樱沟门悸?lián)步驟早期即可獲得更多的激活氨基酸。因此，實現(xiàn)了更快的偶聯(lián)速度，并相應(yīng)地降低了外消旋化的發(fā)生。在眾多實例中，CarboMAX 的應(yīng)用顯著提升了粗制品的純度。
(ii) 避免酸敏感官能團/接頭的非期望裂解：
與碳二亞胺化學(xué)反應(yīng)配合使用的激活劑（如Oxyma Pure）具有酸性，可能在高溫下過早地移除酸敏感基團。CarboMAX 方法通過使用少量的堿（相對于激活氨基酸 0.4 當量的 DIEA）來穩(wěn)定這些酸敏感連接體。這些堿的用量足夠低，不會干擾激活過程，同時保持外消旋化降至蕞低。
03 材料與方法 Materials and Methods
試劑
所有標準的 Fmoc 氨基酸均購自 CEM 公司（位于北卡羅來納州的馬修斯），包含以下側(cè)鏈保護基團：Arg(Pbf)，Asn(Trt)，Asp(OMpe)，Cys(Trt)，Gln(Trt)，Glu(OtBu)，His(Trt)，Lys(Boc)，Ser(tBu)，Thr(tBu)，Trp(Boc)和Tyr(tBu)。磷酸化氨基酸 Fmoc-Ser(PO(OBzl)OH)-OH和Fmoc-Thr(PO(OBzl)OH)-OH，Oxyma Pure 以及 Rink Amide ProTideTM LL 樹脂也購自 CEM 公司（位于北卡羅來納州的馬修斯）。Fmoc-Thr(β-D-GlcNAc(Ac)3)-OH和Fmoc-Lys(palmitoyl-Glu-OtBu)-OH 購自 Bachem（瑞士）。N,N-二異丙基碳二亞胺（DIC），N,N-二異丙基乙胺（DIEA），哌啶，三氟乙酉夋（TFA），3,6-二氧雜-1,8-辛二硫醇（DODT），三異丙基硅烷（TIS）和乙酸購自 Sigma-Aldrich（密蘇里州圣路易斯）。二氯甲烷（DCM），N,N-二甲基甲酰胺（DMF）和無水乙酉迷（Et2O）購自VWR（賓夕法尼亞州西切斯特）。HPLC級水（H2O）和HPLC級乙腈（MeCN）購自Fisher Scientific（馬薩諸塞州沃爾瑟姆）。
肽合成
肽的制備采用 0.05 或 0.1 毫摩爾規(guī)模，使用 CEM Liberty Blue™ 自動化微波肽合成儀，在 0.18 毫摩爾/克的 Rink Amide ProTide LL 樹脂（CEM零件號R002）上進行，除非另有說明。去保護反應(yīng)使用含有20% 哌啶的 DMF 進行。偶聯(lián)反應(yīng)使用 5 當量的氨基酸，以 Fmoc-AA-OH/DIC/Oxyma Pure 在 DMF 中進行。切割步驟使用 CEM Razor 高通量肽切割系統(tǒng)，在升高的溫度下用 TFA/H2O/TIS/DODT 進行 30 分鐘。切割后，肽在冷乙酉迷中沉淀并過夜凍干。
肽分析
肽的分析在配備有 PDA 檢測器的 Waters Acquity UPLC 系統(tǒng)上進行，該系統(tǒng)裝配了 Acquity UPLC BEH C8 柱（1.7 mm 和 2.1 x 100 mm）。UPLC 系統(tǒng)連接到 Waters 3100 Single Quad MS 以進行結(jié)構(gòu)鑒定。峰分析通過 Waters MassLynx 軟件實現(xiàn)。分離采用含有0.05% TFA 的 (i) H2O 和 (ii) MeCN 的梯度洗脫進行。
04 結(jié)果 Results
通過采用 CarboMAX 策略（即相對于氨基酸使用 2 當量的 DIC），相較于傳統(tǒng)的 1 當量使用，顯著提升了肽的純度。
這一改進在 8 種矢口名肽的合成過程中得到了驗證，這些肽分別采用了標準碳二亞胺化學(xué)方法和 CarboMAX 策略進行合成（見表1；圖1至6）。關(guān)鍵的是，在使用過量碳二亞胺的過程中，并未發(fā)現(xiàn)不良封端現(xiàn)象。
表1. 通過應(yīng)用 CarboMAX 偶聯(lián)方法改善了肽的純度
肽 | 粗純度 （標準） | 粗純度 （CarboMAX） |
Thymosin | 63% | 75% |
GRP | 62% | 74% |
Bivalirudin | 80% | 82% |
1-34PTH | 67% | 85% |
35-55MOG | 77% | 91% |
Magainin 1 | 71% | 79% |
Dynorphin A | 74% | 82% |
Liraglutide* | 74% | 88% |
*用~0.32 mmol/g Fmoc-Gly-Wang PS樹脂合成
通過優(yōu)化O-?；愲宓男纬蛇^程，CarboMAX 技術(shù)能夠迅速供應(yīng)更高濃度的活性氨基酸。這一優(yōu)勢對于縮短敏感酯類物質(zhì)在后續(xù)?；磻?yīng)前的存活時間至關(guān)重要。為了證實此效果，研究人員采用了水解、繼之衍生化以及氣相色譜（由 C.A.T. GmbH 執(zhí)行）等手段，對 Liraglutide 序列中各氨基酸的差向異構(gòu)水平進行了深入分析。表 2 的數(shù)據(jù)明顯顯示，在使用 CarboMAX 的過程中觀察到的差向異構(gòu)現(xiàn)象有減少的趨勢，從而佐證了加速O-?；愲迳傻睦碚?。因此，相較于以往描述的任何高溫偶聯(lián)方法，CarboMAX 偶聯(lián)技術(shù)憑借其提升的偶聯(lián)效率和降低的差向異構(gòu)率，實現(xiàn)了更佳的粗制品純度。
表2. 利拉魯月太的差向異構(gòu)化水平
%-D 差向異構(gòu)體 | 2 分鐘 90 °C 標準 | 2 min-90 °C CarboMAX |
D-Ala | 0.33 | 0.25 |
D-Arg | 0.29 | 0.20 |
D-Asp | 0.23 | 0.31 |
D-Glu | 0.39 | 0.30 |
D-Ile L-allo Ile D-allo Ile | <0.10 <0.10 <0.10 | <0.10 <0.10 <0.10 |
D-Leu | 0.17 | 0.13 |
D-Lys | <0.10 | 0.10 |
D-Phe | 0.20 | 0.16 |
D-Ser | 0.16 | 0.12 |
D-Thr L-allo Thr D-allo Thr | <0.10 <0.10 <0.10 | <0.10 <0.10 <0.10 |
D-Trp | 0.24 | <0.10 |
D-Tyr | 0.12 | 0.11 |
D-Tyr | <0.10 | <0.10 |
CarboMAX 策略的一個可選優(yōu)化是在氨基酸反應(yīng)中采用 0.4 當量的堿。這一調(diào)整確保了在整個激活和偶聯(lián)過程中，DIEA（N,N-二異丙基乙胺）以催化量存在，有效地穩(wěn)固了酸敏感鍵合（詳見表 3）。該優(yōu)化最初通過應(yīng)用超酸敏感樹脂鏈接劑進行了驗證。在肽合成領(lǐng)域，運用諸如2-Cl-三苯甲基、三苯甲基（Trt）以及 Cl-TCP 這類超酸敏感鏈接劑至關(guān)重要，它們促進了受保護的肽段的縮合，防止了二酮哌口秦生成，規(guī)避了在樹脂裝載時的DMAP使用，并顯著減少了 C 端半胱氨酉夋殘基發(fā)生β消去的風(fēng)險。
在 90°C 條件下，采用 DIC/Oxyma Pure 進行的標準碳二亞胺偶聯(lián)反應(yīng)僅進行了 2 分鐘，這導(dǎo)致了在三苯甲基樹脂連接劑上合成 ACP 肽的產(chǎn)率不盡人意。不過，當反應(yīng)中加入了 0.1 當量的 DIEA 并在同樣的高溫下實施 CarboMAX 偶聯(lián)策略時，不僅保護了三苯甲基連接劑的鍵穩(wěn)定性，還成功地將產(chǎn)率顯著提升，從原先的 38% 躍升至 96%。這一顯著的提升彰顯了 CarboMAX 偶聯(lián)方法在提高肽合成效率方面的*性。
表3. 使用高酸敏感型 Fmoc-Gly-NovaSyn TGT 樹脂合成ACP
偶聯(lián)溫度（°C） | 偶聯(lián)時間（min） | 激活 | DIEA（當量） | 粗品純度（%） | 粗品收率（%） |
90 | 2 | DIC/Oxyma Pure | 0 | 90 | 38 |
90 | 2 | DIC/Oxyma Pure | 0.1 | 95 | 38 |
65-74ACP: VQAAIDYING
在高溫條件下，涉及磷酸氨基酸衍生物的合成反應(yīng)面臨著由β-消除引起的磷?；鶊F丟失的風(fēng)險，這種風(fēng)險在去保護和酸性切割過程中尤為顯著。此外，一旦磷酸氨基酸被引入到序列中，它所產(chǎn)生的顯著空間位阻會使得后續(xù)殘基的偶聯(lián)變得異常困難。采用 CarboMAX 偶聯(lián)方法并配合 0.4 當量的 DIEA，研究成功合成了以 3 個磷酸氨基酸殘基為主的目標磷酸肽，如圖 7a 所展示的成果。與此形成鮮明對比的是，未添加 DIEA 的合成實驗未能檢測到目標肽的存在（圖 7b）。
TpTGNGKPVECpSQPESSFKMpSFKR
圖7a. 使用 UPLC-MS 分析粗磷酸肽 0.4 等效 DIEA （CarboMAX）
圖7b. 粗磷酸肽的 UPLC-MS 分析（標準品）
此外，O-連接的糖基氨基酸含有可能在高溫碳二亞胺偶聯(lián)過程中斷裂的敏感鍵。通過采用 CarboMAX 偶聯(lián)技術(shù)并添加 0.4 當量的 DIEA，實現(xiàn)了 MUC-1 糖肽的合成，粗品純度高達 72%，如圖 8 所示。值得一提的是，CarboMAX 方法僅需要使用 2 當量的糖基氨基酸過量，這在考慮到糖基化氨基酸昂貴成本的情況下，顯著降低了材料費用，經(jīng)濟效益顯著。
PAHGVT[β-D-GlcNAc(Ac)3]SAPDTRPAPGSTAP
圖8. 使用 UPLC-MS 分析粗 MUC-1 糖肽 0.4 等效 DIEA （CarboMAX）
05 結(jié)論 Conclusion
CarboMAX 方法通過微波輔助的固相肽合成技術(shù)實現(xiàn)了更快的偶聯(lián)反應(yīng)和較低的差向異構(gòu)化。對于昂貴或難以合成的氨基酸殘基，僅需使用 2 當量即可有效進行偶聯(lián)。此外，可選地加入催化量的 DIEA（0.4 當量），有助于在高溫條件下預(yù)防酸敏感鍵的不必要斷裂，從而保護了肽鏈的完整性。
引用 References
(1) J. Collins, K. Porter, S. Singh and G. Vanier, “High-Efficiency Solid Phase Peptide Synthesis (HE-SPPS)," Org. Lett., vol. 16, pp. 940-943, 2014.
(2) Patent Pending: US15686719; EP17188963.7
(3) Patent Pending: US20160176918; EP3037430;JP2016138090; CN105713066; AU2017204172
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