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貨號(hào)	FS-X9580

中文名稱：Caspase3/7活細(xì)胞熒光實(shí)時(shí)法檢測(cè)試劑盒

英文名稱：

產(chǎn)品規(guī)格：100T|50T

貨號(hào)：FS-X9580

產(chǎn)品介紹:

凋亡早期的重要特征之一是半胱氨suan特異性蛋白酶——caspase家族蛋白的活性激活。這一類酶可以參與到一系列的生化反應(yīng)中，響應(yīng)凋亡早期信號(hào)并導(dǎo)致相應(yīng)的蛋白底物剪切，繼而引發(fā)細(xì)胞解體。目的底物可識(shí)別的序列包含天門(mén)冬氨suan殘基，剪切發(fā)生在序列的羰基段。

Caspase3/7活細(xì)胞熒光實(shí)時(shí)法檢測(cè)試劑盒采用新型的熒光底物為原料，可以檢測(cè)凋亡細(xì)胞中激活的caspase3/7.這種具有膜親和型的檢測(cè)試劑盒由一個(gè)4氨基的小肽（DEVD）和一種核酸結(jié)合染料。凋亡發(fā)生時(shí)，caspase3/7蛋白被激活，從而剪切caspase3/7識(shí)別序列DEVD肽段。剪切底物后，游離的核酸染料與DNA結(jié)合，從而發(fā)出亮綠色熒光信號(hào)。

操作步驟

1.1 以合適的培養(yǎng)基懸浮細(xì)胞或貼壁細(xì)胞，加入合適的化合物或藥物，刺激細(xì)胞誘導(dǎo)凋亡。

1.2 去除藥物或化合物，以新鮮培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞2-3次，更換新鮮培養(yǎng)基后，以1μL/mL的量加入caspase3/7檢測(cè)液，使得caspase3/7檢測(cè)試劑工作液濃度為1μM。（注意： Caspase3/7 檢測(cè)試劑工作液濃度為0.5μM~2μM，您根據(jù)細(xì)胞量以及培養(yǎng)液的體積進(jìn)行調(diào)整優(yōu)化。）

1.3 37℃，避光孵育30min，或室溫孵育45-60min。

1.4 熒光顯微鏡觀察拍照或熒光光度計(jì)讀數(shù)。

培養(yǎng)操作步驟：

1．公司僅用于科研用蓋片鑷將蓋玻片自75%乙醇中取出，用無(wú)菌絲綢布擦拭干凈，不要用紗布；

2．將蓋玻片輕輕放入6孔培養(yǎng)板（每孔一片）或培養(yǎng)皿中（每個(gè)平皿可放置2-3片）；

3．在距離紫外燈直射范圍內(nèi)20-30 厘米處照射2-3小時(shí)；

4．將經(jīng)過(guò)計(jì)數(shù)的細(xì)胞懸浮液移入培養(yǎng)板中，使蓋玻片*浸在培養(yǎng)液中；

5．將培養(yǎng)板在5% CO2水浴孵箱中37℃孵育2-3天，當(dāng)貼壁細(xì)胞生長(zhǎng)至覆蓋培養(yǎng)板底部2/3面積時(shí)，將培養(yǎng)板取出，用蓋片鑷輕輕取出蓋玻片，用蒸餾水漂洗后即可進(jìn)行快速固定以及免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)。

實(shí)驗(yàn)報(bào)告：

一、分離與培養(yǎng)：

1、無(wú)菌條件下，取出1-3d 齡SD大鼠心房組織，然后用PBS將此組織塊清洗2次，最后將組織剪成1mm3左右大?。?/span>

2、往組織塊中加入4 mL酶消化液（0.1% 和0.1% I型膠原酶），混懸10s，置37℃條件下消化10min，之后用滴管吹打制成單細(xì)胞懸液，自然沉淀并收集上清，用含10% FBS培養(yǎng)基終止消化后4℃放置；

3、剩下的組織再加入3～4mL酶消化液，混懸10s，置37℃消化10 min后，按上述方法收集上清并終止消化后4℃放置，重復(fù)此步驟2-3次，直至組織*被消化；

4、用200目不銹鋼篩網(wǎng)過(guò)濾細(xì)胞消化液，1200r/min 離心10min，棄去上清，沉淀細(xì)胞用含有10％ FBS DMEM/F12培養(yǎng)基混懸，接種于25cm2培養(yǎng)瓶，放置于37℃ ，5％CO2 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；

5、差速貼壁1h后，吸出培養(yǎng)基，按實(shí)驗(yàn)需要接種于6孔板中繼續(xù)培養(yǎng)；

二、免疫熒光鑒定：

1、待心房肌細(xì)胞生長(zhǎng)至80%融合時(shí)，棄去培養(yǎng)基，用溫育的PBS沖洗細(xì)胞2次，每次10min，然后用4%多聚甲醛在室溫條件下固定細(xì)胞15min；

2、PBS沖洗細(xì)胞2次，每次10min，然后在4℃條件下，用0.1％Triton X-100透膜15min；

3、PBS沖洗細(xì)胞2次，每次10min，然后在室溫條件下，用4% BSA封閉細(xì)胞30min；

4、按1: 100的比例稀釋?duì)?actin一抗，然后將其放在4℃冰箱中孵育細(xì)胞過(guò)夜；

5、PBS沖洗細(xì)胞3次，每次10min，按1：150的比例稀釋抗α-actin的二抗， 37℃條件下放置1h；

6、用PBS沖洗3次，每次10min，最后在倒置熒光顯微鏡下觀察圖像并拍照。

操作規(guī)程

1、在96孔板加入細(xì)胞100μL/孔，通常細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)每孔加入100微升2000個(gè)細(xì)胞，細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)每孔加入100微升5000～10000個(gè)細(xì)胞（具體每孔所用的細(xì)胞的數(shù)目，需根據(jù)細(xì)胞的大小，細(xì)胞增殖速度的快慢等決定）。置37℃ 5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)24小時(shí).

2、.加入適當(dāng)濃度的0～10μL 受試化合物。

3、將96孔板在37℃，含5% CO2空氣及100%濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育適當(dāng)時(shí)間。

4、將5×MTT 用稀釋液稀釋成1× MTT 溶液。

5、每孔加50μL 1× MTT 溶液，在37℃孵育4小時(shí)，使MTT 還原為甲臜。

6、吸出上清液，每孔加150μL DMSO 使甲臜溶解，用平板搖床搖勻。

7、酶標(biāo)儀在570nm 波長(zhǎng)處檢測(cè)每孔的光密度（如無(wú)570nm 濾光片，可以使用560-600nm 的濾光片）。

8、結(jié)果分析

a、細(xì)胞的存活率：將各測(cè)試孔的OD 值減去本底OD 值（*培養(yǎng)基加MTT，無(wú)細(xì)胞）或空白藥物孔OD 值（*培養(yǎng)基加受試藥物的不同稀釋度加MTT，無(wú)細(xì)胞），各重復(fù)孔的OD 值取平均數(shù)±SD。細(xì)胞的存活率以T/C%表示，T 為加藥細(xì)胞的OD 值，C 為對(duì)照細(xì)胞的OD 值。細(xì)胞存活率% =（加藥細(xì)胞OD/對(duì)照細(xì)胞OD）×100

b、求出T/C = 50% 時(shí)的藥物濃度(IC50)及T/C = 10%時(shí)的藥物濃度(IC90)

一氧化氮合mei運(yùn)輸因子(NOSTRIN)elisa檢測(cè)試劑盒英文名稱：NOSTRIN ELISA Kit，NOSTRIN，

煙型受體α3(CHRNα3)elisa檢測(cè)試劑盒英文名稱：CHRNα3 ELISA Kit，CHRNα3，

血小板反應(yīng)蛋白2(THBS2)elisa檢測(cè)試劑盒英文名稱：THBS2 ELISA Kit，THBS2，

阿mi巴(Amebiasis)elisa檢測(cè)試劑盒英文名稱：Amebiasis ELISA Kit，Amebiasis，

α輔肌動(dòng)蛋白4(ACTN-4)elisa檢測(cè)試劑盒英文名稱：ACTN-4 ELISA Kit，ACTN-4，

β干擾su(IFN-β/IFNB)elisa檢測(cè)試劑盒英文名稱：IFN-β/IFNB ELISA Kit，IFN-β/IFNB，

Toll樣受體4(TLR4)elisa檢測(cè)試劑盒英文名稱：TLR4 ELISA Kit，TLR4，

P物質(zhì)受體(SP-R)elisa檢測(cè)試劑盒英文名稱：SP-R ELISA Kit，SP-R，

H-鈣粘著蛋白/H-鈣粘連蛋白(H-Cad/CDH13)elisa檢測(cè)試劑盒英文名稱：H-Cad/CDH13 ELISA Kit，H-Cad/CDH13，

CX3C趨化因子受體1(CX3CR1)elisa檢測(cè)試劑盒英文名稱：CX3CR1 ELISA Kit，CX3CR1，

B細(xì)胞受體相關(guān)蛋白31(BCAP31)elisa檢測(cè)試劑盒英文名稱：BCAP31 ELISA Kit，BCAP31，

Ⅲ型膠原(Col Ⅲ)elisa檢測(cè)試劑盒英文名稱：Col Ⅲ ELISA Kit，Col Ⅲ，

3型1-磷suan鞘氨chun受體(S1P3)elisa檢測(cè)試劑盒英文名稱：S1P3 ELISA Kit，S1P3，

脂聯(lián)su(Adiponectin)elisa檢測(cè)試劑盒英文名稱：Adiponectin ELISA Kit，Adiponectin，

黑su瘤衍生亮氨suan拉鏈額外核因子(MLZE)elisa檢測(cè)試劑盒英文名稱：MLZE ELISA Kit，MLZE，

(GSH)elisa檢測(cè)試劑盒英文名稱：GSH ELISA Kit，GSH，

胱天蛋白mei激活的脫氧核糖核suanmei(CAD)elisa檢測(cè)試劑盒英文名稱：CAD ELISA Kit，CAD，
Caspase3/7活細(xì)胞熒光實(shí)時(shí)法檢測(cè)試劑盒哌拉西標(biāo)準(zhǔn)品規(guī)格:500mg 英文名稱：Piperacillin

環(huán)丙氨嗪標(biāo)準(zhǔn)品規(guī)格:200mg 英文名稱：Cyromazine

碘海chun標(biāo)準(zhǔn)品規(guī)格:200mg 英文名稱：Iohexol

jia磺suan培高利特標(biāo)準(zhǔn)品規(guī)格:200mg 英文名稱：Pergolide Mesylate

尼莫地標(biāo)準(zhǔn)品規(guī)格:125mg 英文名稱：Nimodipine

tong芬相關(guān)物質(zhì)D標(biāo)準(zhǔn)品規(guī)格:20mg 英文名稱：

噻康zuo標(biāo)準(zhǔn)品規(guī)格:200mg 英文名稱：Tioconazole

benjiasuan標(biāo)準(zhǔn)品規(guī)格:300mg 英文名稱：Benzoic Acid

L-賴氨suan鹽suan鹽標(biāo)準(zhǔn)品規(guī)格:200mg 英文名稱：L-Lysine Hydrochloride

齊夫定相關(guān)物質(zhì)C標(biāo)準(zhǔn)品規(guī)格:100mg 英文名稱：