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貨號(hào)	FS-X9627

中文名稱(chēng)：AnnexinV-APC/7-AAD細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒

英文名稱(chēng)：Annexin V-APC/7-AAD Apoptosis Detection Kit

產(chǎn)品規(guī)格：20T

貨號(hào)：FS-X9627

產(chǎn)品介紹:

Annexin V-APC/7-AAD細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒是用熒光素APC標(biāo)記的Annexin V作為探針，來(lái)檢測(cè)細(xì)胞早期凋亡的發(fā)生，可用流式細(xì)胞儀或其他熒光檢測(cè)設(shè)備進(jìn)行檢測(cè)。

其檢測(cè)原理為：在正常的活細(xì)胞中，磷脂酰絲氨suan（phosphotidylserine，PS）位于細(xì)胞膜的內(nèi)側(cè)，但在早期凋亡的細(xì)胞中，PS從細(xì)胞膜的內(nèi)側(cè)翻轉(zhuǎn)到細(xì)胞膜的表面，暴露在細(xì)胞外環(huán)境中。Annexin-V（膜聯(lián)蛋白-V）是一種分子量為35-36KD的Ca2+ 依賴(lài)性磷脂結(jié)合蛋白，能與PS高親和力結(jié)合。可通過(guò)細(xì)胞外側(cè)暴露的磷脂酰絲氨suan與凋亡早期細(xì)胞的胞膜結(jié)合。

另外，本試劑盒中提供的7-AAD可用來(lái)區(qū)分存活的早期細(xì)胞和壞死或晚期凋亡細(xì)胞。7-AAD是一種核酸染料，同PI有著相似的熒光特性，但其發(fā)射光譜較PI窄，對(duì)其他檢測(cè)通道的干擾更小，在多色熒光分析中是PI的佳替代品，可與Annexin V聯(lián)合使用。該染料不能透過(guò)正常細(xì)胞或早期凋亡細(xì)胞的完整的細(xì)胞膜，但可穿透晚期凋亡細(xì)胞或者壞死細(xì)胞并與其內(nèi)的DNA結(jié)合。因此將Annexin V-APC與7-AAD聯(lián)合使用時(shí)，7-AAD則被排除在活細(xì)胞（Annexin V-/7-AAD-）和早期凋亡細(xì)胞（Annexin V+/7-AAD-）之外，而晚期凋亡細(xì)胞和壞死細(xì)胞同時(shí)被Annexin V-APC和7-AAD結(jié)合染色呈現(xiàn)雙陽(yáng)性（Annexin V+/7-AAD+）。

試劑盒組份：

重組人Annexin V/APC*（rh Annexin V/APC）———100μl

7-AAD Viability Staining Solution——————100μl

1×Binding buffer——————————————10ml

儲(chǔ)存條件：4℃，有效期一年。

培養(yǎng)操作步驟：

1．公司僅用于科研用蓋片鑷將蓋玻片自75%乙醇中取出，用無(wú)菌絲綢布擦拭干凈，不要用紗布；

2．將蓋玻片輕輕放入6孔培養(yǎng)板（每孔一片）或培養(yǎng)皿中（每個(gè)平皿可放置2-3片）；

3．在距離紫外燈直射范圍內(nèi)20-30 厘米處照射2-3小時(shí)；

4．將經(jīng)過(guò)計(jì)數(shù)的細(xì)胞懸浮液移入培養(yǎng)板中，使蓋玻片*浸在培養(yǎng)液中；

5．將培養(yǎng)板在5% CO2水浴孵箱中37℃孵育2-3天，當(dāng)貼壁細(xì)胞生長(zhǎng)至覆蓋培養(yǎng)板底部2/3面積時(shí)，將培養(yǎng)板取出，用蓋片鑷輕輕取出蓋玻片，用蒸餾水漂洗后即可進(jìn)行快速固定以及免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)。

實(shí)驗(yàn)報(bào)告：

一、分離與培養(yǎng)：

1、無(wú)菌條件下，取出1-3d 齡SD大鼠心房組織，然后用PBS將此組織塊清洗2次，最后將組織剪成1mm3左右大?。?/span>

2、往組織塊中加入4 mL酶消化液（0.1% 和0.1% I型膠原酶），混懸10s，置37℃條件下消化10min，之后用滴管吹打制成單細(xì)胞懸液，自然沉淀并收集上清，用含10% FBS培養(yǎng)基終止消化后4℃放置；

3、剩下的組織再加入3～4mL酶消化液，混懸10s，置37℃消化10 min后，按上述方法收集上清并終止消化后4℃放置，重復(fù)此步驟2-3次，直至組織*被消化；

4、用200目不銹鋼篩網(wǎng)過(guò)濾細(xì)胞消化液，1200r/min 離心10min，棄去上清，沉淀細(xì)胞用含有10％ FBS DMEM/F12培養(yǎng)基混懸，接種于25cm2培養(yǎng)瓶，放置于37℃ ，5％CO2 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；

5、差速貼壁1h后，吸出培養(yǎng)基，按實(shí)驗(yàn)需要接種于6孔板中繼續(xù)培養(yǎng)；

二、免疫熒光鑒定：

1、待心房肌細(xì)胞生長(zhǎng)至80%融合時(shí)，棄去培養(yǎng)基，用溫育的PBS沖洗細(xì)胞2次，每次10min，然后用4%多聚甲醛在室溫條件下固定細(xì)胞15min；

2、PBS沖洗細(xì)胞2次，每次10min，然后在4℃條件下，用0.1％Triton X-100透膜15min；

3、PBS沖洗細(xì)胞2次，每次10min，然后在室溫條件下，用4% BSA封閉細(xì)胞30min；

4、按1: 100的比例稀釋?duì)?actin一抗，然后將其放在4℃冰箱中孵育細(xì)胞過(guò)夜；

5、PBS沖洗細(xì)胞3次，每次10min，按1：150的比例稀釋抗α-actin的二抗， 37℃條件下放置1h；

6、用PBS沖洗3次，每次10min，最后在倒置熒光顯微鏡下觀察圖像并拍照。

操作規(guī)程

1、在96孔板加入細(xì)胞100μL/孔，通常細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)每孔加入100微升2000個(gè)細(xì)胞，細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)每孔加入100微升5000～10000個(gè)細(xì)胞（具體每孔所用的細(xì)胞的數(shù)目，需根據(jù)細(xì)胞的大小，細(xì)胞增殖速度的快慢等決定）。置37℃ 5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)24小時(shí).

2、.加入適當(dāng)濃度的0～10μL 受試化合物。

3、將96孔板在37℃，含5% CO2空氣及100%濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育適當(dāng)時(shí)間。

4、將5×MTT 用稀釋液稀釋成1× MTT 溶液。

5、每孔加50μL 1× MTT 溶液，在37℃孵育4小時(shí)，使MTT 還原為甲臜。

6、吸出上清液，每孔加150μL DMSO 使甲臜溶解，用平板搖床搖勻。

7、酶標(biāo)儀在570nm 波長(zhǎng)處檢測(cè)每孔的光密度（如無(wú)570nm 濾光片，可以使用560-600nm 的濾光片）。

8、結(jié)果分析

a、細(xì)胞的存活率：將各測(cè)試孔的OD 值減去本底OD 值（*培養(yǎng)基加MTT，無(wú)細(xì)胞）或空白藥物孔OD 值（*培養(yǎng)基加受試藥物的不同稀釋度加MTT，無(wú)細(xì)胞），各重復(fù)孔的OD 值取平均數(shù)±SD。細(xì)胞的存活率以T/C%表示，T 為加藥細(xì)胞的OD 值，C 為對(duì)照細(xì)胞的OD 值。細(xì)胞存活率% =（加藥細(xì)胞OD/對(duì)照細(xì)胞OD）×100

b、求出T/C = 50% 時(shí)的藥物濃度(IC50)及T/C = 10%時(shí)的藥物濃度(IC90)

維生suB2(VB2)elisa檢測(cè)試劑盒英文名稱(chēng)：VB2 ELISA Kit，VB2，

鐵-過(guò)氧化物岐化mei(Fe-SOD)elisa檢測(cè)試劑盒英文名稱(chēng)：Fe-SOD ELISA Kit，F(xiàn)e-SOD，

Jagged1蛋白(JAG1)elisa檢測(cè)試劑盒英文名稱(chēng)：JAG1 ELISA Kit，JAG1，

Embigin蛋白(EMB)elisa檢測(cè)試劑盒英文名稱(chēng)：EMB ELISA Kit，EMB，

GPI錨定分子樣蛋白(GML)elisa檢測(cè)試劑盒英文名稱(chēng)：GML ELISA Kit，GML，

Cylindromatosis蛋白(CYLD)elisa檢測(cè)試劑盒英文名稱(chēng)：CYLD ELISA Kit，CYLD，

CD8a分子(CD8a)elisa檢測(cè)試劑盒英文名稱(chēng)：CD8a ELISA Kit，CD8a，

B-黑色su瘤抗原5(BAGE5)elisa檢測(cè)試劑盒英文名稱(chēng)：BAGE5 ELISA Kit，BAGE5，

Apelin13蛋白(AP13)elisa檢測(cè)試劑盒英文名稱(chēng)：AP13 ELISA Kit，AP13，

Ⅶ型膠原(COL7)elisa檢測(cè)試劑盒英文名稱(chēng)：COL7 ELISA Kit，COL7，

70kDa熱休克蛋白結(jié)合蛋白1(HSPBP1)elisa檢測(cè)試劑盒英文名稱(chēng)：HSPBP1 ELISA Kit，HSPBP1，

2,3-二磷suan甘油suan(2,3-BPG)elisa檢測(cè)試劑盒英文名稱(chēng)：2,3-BPG ELISA Kit，2,3-BPG，

組蛋白去乙酰化mei3(HDAC3)elisa檢測(cè)試劑盒英文名稱(chēng)：HDAC3 ELISA Kit，HDAC3，

胞漿磷蛋白4(STMN4)elisa檢測(cè)試劑盒英文名稱(chēng)：STMN4 ELISA Kit，STMN4，

白介su28B(IL28B)elisa檢測(cè)試劑盒英文名稱(chēng)：IL28B ELISA Kit，IL28B，

半胱氨suan蛋白mei抑制劑7(CST7)elisa檢測(cè)試劑盒英文名稱(chēng)：CST7 ELISA Kit，CST7，

白介su12A(IL12A)elisa檢測(cè)試劑盒英文名稱(chēng)：IL12A ELISA Kit，IL12A，
AnnexinV-APC/7-AAD細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒金絲桃甙標(biāo)準(zhǔn)品規(guī)格:50mg 英文名稱(chēng)：Hyperoside

相關(guān)物質(zhì)A標(biāo)準(zhǔn)品規(guī)格:50mg 英文名稱(chēng)：

lv醛比林標(biāo)準(zhǔn)品規(guī)格:200mg 英文名稱(chēng)：Dichloralphenazone CIV

蔓荊子黃su標(biāo)準(zhǔn)品規(guī)格:25mg 英文名稱(chēng)：Casticin

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fu哌噻噸標(biāo)準(zhǔn)品規(guī)格:25mg 英文名稱(chēng)：Equilin

碳suan鈣標(biāo)準(zhǔn)品規(guī)格:1g 英文名稱(chēng)：Calcium Carbonate (AS)

肌suan二鈉標(biāo)準(zhǔn)品規(guī)格:500mg 英文名稱(chēng)：Disodium Inosinate