細(xì)胞凍存注意事項(xiàng)：
(1)  細(xì)胞的收獲
用來凍存的細(xì)胞一般選擇在細(xì)胞約鋪滿 90% 的時候，這時細(xì)胞生長狀態(tài)好，細(xì)胞數(shù)量也多，并且在收獲細(xì)胞前 24 小時換一次培養(yǎng)液。收獲用來凍存的細(xì)胞開始時方法和平時一樣，用 100xg 離心 5 分鐘收集細(xì)胞再重懸，活細(xì)胞記數(shù)。稀釋或濃縮到細(xì)胞保存的最終細(xì)胞濃度的二倍(一般是 400-1000 萬 細(xì)胞 /ml )，加入已經(jīng)配好的等體積的培養(yǎng)液保護(hù)劑混合溶液中輕輕混勻，分裝到凍存管，冷凍保存。
(2)  保護(hù)劑的使用
細(xì)胞凍存中， 一般使用DMSO 作為保護(hù)劑。在細(xì)胞凍存中， DMSO 使用的最終濃度一般是 5-15% ，某種具體細(xì)胞的凍存液中的DMSO濃度可以從ATCC查到。對特別敏感的細(xì)胞特別是雜交瘤細(xì)胞在凍存時使用 95% 血清和 5%DMSO 可能會好些。保護(hù)劑在使用時先用培養(yǎng)液或血清配成最終濃度的2倍，再與等體積的懸浮細(xì)胞的培養(yǎng)液混合。
(3)  細(xì)胞凍存的速率
細(xì)胞的冷凍速率最適控制在讓細(xì)胞有足夠的時間脫水而又不被過度脫水導(dǎo)致細(xì)胞損害。對大多數(shù)細(xì)胞來說，每分鐘降 1 至 3 ℃是合適的。通常的操作是把細(xì)胞先在-20℃1-2個小時，再放入 -80℃冰箱過夜(如果沒有-80℃冰箱，可以用干冰替代)，再轉(zhuǎn)入液氮罐或低于 -130℃的冰箱長期保存。
(4)  儲存環(huán)境
細(xì)胞長期保存溫度是 -130 ℃或更低。液氮罐中氣態(tài)層溫度在 -140℃至 -180℃之間，細(xì)胞可保存在氣態(tài)層或浸入液氮中，如果可能最好保存在氣態(tài)層，因?yàn)檫@樣可避免由于有液氮進(jìn)入凍存管而在拿出細(xì)胞時引起爆炸(但是這樣液氮罐內(nèi)只能存儲少量液氮，需要經(jīng)常添加)。細(xì)胞也可以在-80℃冰箱保存幾個月左右的時間。

操作步驟:

(1) 細(xì)胞系培養(yǎng)：取6cm細(xì)胞皿，向每孔中加入2mL含1~2×105個細(xì)胞培養(yǎng)液，37℃ CO2培養(yǎng)密度至40%~60%，密度過大，轉(zhuǎn)染后不利篩選細(xì)胞。

(2) 轉(zhuǎn)染液制備：在EP管中制備以下兩液(為轉(zhuǎn)染每一個孔細(xì)胞所用的量)

A液：用不含血清培養(yǎng)基稀釋1ug 質(zhì)粒DNA。

B液：用不含血清培養(yǎng)基稀釋2ul脂質(zhì)體。

分別將A液與B液輕彈混勻，靜置5分鐘。

(3) 吸取B液加入至A液中，輕彈混勻。室溫中置10-15分鐘。

(4) 轉(zhuǎn)染準(zhǔn)備：用1mL不含血清培養(yǎng)液漂洗兩次，再加入4mL不含血清培養(yǎng)液。

(5) 轉(zhuǎn)染：把A/B復(fù)合物緩緩加入培養(yǎng)液中，搖勻，37℃溫箱置6~24小時，吸除無血清轉(zhuǎn)染液，換入正常培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。

(6) 瞬時轉(zhuǎn)染后，可在48h-72h細(xì)胞長滿之后，提取細(xì)胞蛋白或者RNA，驗(yàn)證敲減/過表達(dá)效率。

公司正在出售的產(chǎn)品：

DEK癌基因結(jié)合蛋白磷酸化肌球蛋白調(diào)節(jié)多肽9(平滑肌亞型)抗體　英文名；Myosin light chain (phospho S20)

DELE蛋白抗體磷酸化肌球蛋白調(diào)節(jié)輕鏈12B抗體　英文名；phospho-MYL12B (Thr19 + Ser20)

DeltaD抗體磷酸化肌球蛋白調(diào)節(jié)輕鏈MRLC3抗體　英文名；phospho-MRCL3 (Thr18 + Ser19)

DENND1A蛋白抗體磷酸化肌肉型6磷酸果糖激酶/磷酸果糖激酶1抗體　英文名；phospho-PFKM/PFK1 (Ser775)

DENND1B蛋白抗體磷酸化肌細(xì)胞特異性增強(qiáng)因子2D抗體　英文名；phospho-MEF2D (Ser444)

DENND1C蛋白抗體磷酸化肌細(xì)胞增強(qiáng)因子2C抗體　英文名；phospho-MEF2C (Ser396)

DENND2A蛋白抗體磷酸化肌細(xì)胞增強(qiáng)因子2抗體　英文名；Phospho-MEF2A (Ser408)

DENND3蛋白抗體磷酸化肌原調(diào)節(jié)蛋白抗體　英文名；phospho-MyoD1 (Ser200)

DENND4A蛋白抗體磷酸化基底膜相關(guān)軟骨素蛋白多糖抗體　英文名；phospho-SMC3 (Ser1083)

DENND4B蛋白抗體磷酸化基質(zhì)重塑相關(guān)蛋白PARVA抗體　英文名；phospho-Parvin alpha (Ser8)

DENND5A蛋白抗體磷酸化急性髓細(xì)胞白血病1蛋白抗體　英文名；phospho-RUNX1 (Ser249)

牛胚氣管細(xì)胞；EBTr (NBL-4)DENND5B蛋白抗體磷酸化脊髓小腦失調(diào)癥蛋白1抗體　英文名；phospho-Ataxin 1 (Ser775)

DENN域內(nèi)含蛋白2D抗體磷酸化甲狀腺受體相關(guān)蛋白220抗體　英文名；phospho-TRAP220 (Thr1457)

DEPTOR蛋白抗體磷酸化鉀通道蛋白DRK1抗體　英文名；phospho-Kv2.1 (Tyr128)