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簡介
在制藥和醫(yī)療器械生產過程中，對污染物樣品的監(jiān)測是一個關鍵步驟。內毒素存在于革蘭氏陰性細菌的細胞壁中，是一種常見的污染物，可引起發(fā)燒、炎癥、頭痛、甚至死亡。內毒素的常規(guī)檢測方法是鱟試劑溶酶法 (LAL)，核心成分是鱟的血液中提取而來。在內毒素存在的情況下，LAL通過酶促級聯(lián)凝固，可以通過比濁法或顯色法定量 ( 圖 1A )。這些方法涉及多個酶的步驟，并取決于鱟的可用性。龍沙公司生產的 PyroGene 重組因子 C 試劑盒 (rFC) 提供一種定量檢測的方法，通過一步酶促反應，不借助于動物衍生產品，與 LAL 方法具有相同的靈敏度。在內毒素存在的情況下，活化的 rFC 會裂解熒光基質，導致熒光信號的增加 ( 圖 1B )，這與內毒素的含量成正比。

材料
• PyroGene 重組因子 C 終點法熒光檢測試劑盒 (Lonza cat. #50-658U)
• LAL Reagent Grade™ Multi-well Plates (Lonza cat. #25-340)
• Pyrogen-free Dilution Tubes Lonza cat. #N207)
• LAL Reagent Water (Lonza cat. #W50-640)
• SpectraMax i3 或 i3x 多功能微孔板讀板機 ( Molecular Devices 公司其它支持熒光檢測的微孔板讀板機均可以使用 )
• SoftMax Pro 軟件 (Molecular Devices)

優(yōu)勢
• 一步酶促反應以及非動物衍生產品特點完成檢測，可確保樣本的安全性
• 利用 SpectraMax 系列微孔板讀板機可獲得更高的靈敏度
• SoftMax Pro 軟件的 Workflow方式進行讀取-孵育-讀取的自動化流程節(jié)省了大量時間

方法
用試劑盒提供的凍干的 E. coli O55:B5 內毒素按照瓶上 LAL 試劑水的體積進行配置，得到 20 EU/mL 的原液。將配置好的原液高速震蕩混勻 15 分鐘，用旋渦攪拌器使其*溶解。用 LAL 試劑水稀釋原液，每次稀釋時用力搖勻，制得濃度標準:5 EU/mL、0.5 EU/mL、0.05 EU/mL、0.005 EU/mL、0.001 EU/mL。經過優(yōu)化后 PyroGene 試劑盒檢測的線性范圍為0.005 EU/mL 至 5.0 EU/mL，增加了額外的標準品濃度 (0.001 EU/mL)，以測試SpectraMax i3 讀板機的靈敏度。
讀板機的溫度設置在 37℃，在實驗前等待其內部溫度升至 37℃。取 100 µL 空白對照和內毒素標準品 ( 3 復孔 ) 加入到微孔板的孔中。該微孔板放置在讀板機內 37℃ 孵育至少 10 min。在預孵育過程中，分別以 5:4:1 的比例將熒光基質、檢測緩沖液和 rFC 酶溶液混合制備工作液。在預孵育 10 分鐘后取 100µL 工作液添加到每個孔。
SpectraMax i3 讀板機的溫度在實驗期間維持在 37℃。使用表一中顯示的設置在 0時刻讀板 ( 加入工作液后 )。在 SoftMaxPro 軟件中設置 PMT 增益值為自動獲取，可以確保在不需要確定靈敏度設置的情況下，在整個樣本范圍內獲得準確的結果。初始進行板高優(yōu)化，優(yōu)化后的 2 mm 讀高用于后續(xù)檢測。在first讀數 (T0) 后,微孔板在讀板機內37℃ 孵育 1 小時，然后用同樣的設置讀取第 2 次。讀取-孵育-讀取的工作流程可以在SoftMax Pro 軟件設置自動讀取 ( 圖 2 )。在第二次讀數后 (T60), 每個標準品使用以下算法計算 ΔRFU：(STDT60-STDT0) ?(BLT60-BLT0)
• STDT60 是 1 小時時標準品的 RFU
• STDT0 是 0 時刻時標準品的 RFU
• BLT60 是 1 小時時空白對照的 RFU
• BLT0 是 0 時刻時空白對照的 RFU

結果
SpectraMax i3 讀板機滿足 PyroGene 試劑盒的各種要求，使用 ΔRFU 的 log 值和濃度的 log 值在 SoftMax Pro 軟件中繪制標準曲線 ( 圖 3 )采用五個梯度的內毒素稀釋液 ( 濃度從0.001 EU/mL 到 5 EU/mL ) 進行檢測。重復標準的 CV 低于 5%。R2 值為 0.996，標準曲線在這一擴展的濃度范圍內顯示出良好的線性。SpectraMax i3 讀板機能夠檢測到比產品說明書中建議的范圍 ( 0.005EU/mL 到 5.0 EU/mL ) 更低的內毒素濃度，顯示其具有更高的熒光檢測靈敏度。
總結
標準曲線在低濃度復孔間的變異很小，而且靈敏度低于建議的檢測下限，展現(xiàn)了SpectraMax i3 多功能讀板機在進行
GyroGene 重組因子 C 檢測時具有非常優(yōu)異性能優(yōu)勢。用 SpectraMax i3x 讀板機和其他熒光檢測的 SpectraMax 讀板機也可以得到類似的結果。
SoftMax Pro 軟件可用于分析數據，ΔRFU值用于繪制標準曲線，計算生成 R2，并顯示出該讀板機在低濃度內毒素檢測的靈敏度。

• SpectraMaxMini多功能酶標儀

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