【儀表網(wǎng) 研發(fā)快訊】近日，北京大學(xué)化學(xué)與分子工程學(xué)院彭海琳課題組與合作者發(fā)表了題為“Self-assembled superstructure alleviates air-water interface effect in cryo-EM”的研究論文(Nature Commun .2024, 15, 7300)，報(bào)道了基于石墨烯-硬脂酸分子自組裝層復(fù)合結(jié)構(gòu)(GSAMs)的冷凍電鏡載網(wǎng)，該復(fù)合結(jié)構(gòu)在冷凍制樣時(shí)顯著抑制了生物蛋白分子因吸附在氣液界面而導(dǎo)致的結(jié)構(gòu)變性和優(yōu)勢取向問題。同時(shí)，GSAMs能顯著豐富蛋白分子在無定形冰中的取向，有利于實(shí)現(xiàn)單顆粒冷凍電鏡的高分辨結(jié)構(gòu)解析。通過GSAMs，研究團(tuán)隊(duì)成功實(shí)現(xiàn)多種蛋白近原子級(jí)分辨率的三維結(jié)構(gòu)解析。
 

論文截圖
 

圖1 GSAMs復(fù)合膜在冷凍電鏡成像中的優(yōu)勢：減輕氣液界面吸附與豐富樣品取向
 

　　單顆粒冷凍電鏡是目前揭示生物大分子精細(xì)結(jié)構(gòu)和反應(yīng)機(jī)理的重要手段之一。在冷凍電鏡成像過程中，生物大分子被封裝在薄層玻璃態(tài)冰中，在電子束輻照下，仍處于原始結(jié)構(gòu)和本征狀態(tài)。然而對(duì)于蛋白質(zhì)而言，絕大多數(shù)蛋白質(zhì)顆粒在冷凍制樣時(shí)均傾向于吸附在空氣-液體的界面處。吸附在氣液界面的樣品容易發(fā)生結(jié)構(gòu)變性，并產(chǎn)生單一的優(yōu)勢取向，嚴(yán)重制約蛋白質(zhì)的高分辨結(jié)構(gòu)解析。為解決這個(gè)難題，業(yè)內(nèi)通常引入一層無定形碳膜以避免氣液界面問題，但是無定形碳膜厚度高達(dá)3nm，在電鏡下背景噪音大，并且電子輻照時(shí)會(huì)產(chǎn)生較大的樣品漂移，顯著降低成像質(zhì)量。
 

　　近年來，彭海琳課題組致力于開發(fā)單原子層厚度的石墨烯功能薄膜及其電鏡載網(wǎng)技術(shù)，清華大學(xué)王宏偉課題組致力于發(fā)展新型冷凍電鏡成像方法及機(jī)理研究。雙方強(qiáng)強(qiáng)聯(lián)合，基于懸空石墨烯功能膜解決冷凍電鏡成像存在的氣液界面、優(yōu)勢取向、冰層控制、樣品飄移等問題，以提升冷凍電鏡成像分辨率，取得了一系列研究成果(Adv. Mater . 2017; Structure 2017; J. Am. Chem. Soc . 2019; Nature Commun.  2019; Nature Commun.  2020; Biophysics Reports  2021; ACS Nano  2021; Nature Commun.  2022; Nat. Methods  2023; J. Am. Chem. Soc.  2023)。2024年1月，王宏偉課題組和彭海琳課題組進(jìn)一步合作開發(fā)了一種基于石墨烯“三明治”結(jié)構(gòu)的冷凍電鏡生物樣品制備方法，以“石墨烯三明治技術(shù)用以生物冷凍電鏡結(jié)構(gòu)解析”(Graphene sandwich-based biological specimen preparation for cryo-EM analysis)為題發(fā)表在PNAS(2024,121(5), e2309384121)期刊上。該研究通過兩層石墨烯對(duì)生物樣品溶液進(jìn)行封裝，制備冰層厚度適宜的石墨烯“三明治”樣品用于高分辨冷凍電鏡重構(gòu)。生物大分子被封裝在兩層石墨烯薄膜之間，從而徹底避免了氣液界面的影響。并且由于石墨烯優(yōu)異的機(jī)械強(qiáng)度和導(dǎo)電性能，該方法還可以有效抑制冰層形變，降低電鏡成像過程中的顆粒漂移和冷凍樣品在透射電鏡下的電荷積累效應(yīng)，從而進(jìn)一步提高冷凍電鏡照片的質(zhì)量。該工作被Nature Methods作為亮點(diǎn)進(jìn)行報(bào)道(Graphene sandwich for cryo-EM)。
 

　　圖2“石墨烯三明治結(jié)構(gòu)”冷凍電鏡樣品制備示意圖(PNAS 2024,121, e2309384121)
 

　　在最新的研究工作中(Nature Commun . 2024, 15 , 7300)，研究團(tuán)隊(duì)基于硬脂酸分子在石墨烯表面的自組裝行為，獲得液面上自支撐的大面積石墨烯薄膜，即GSAMs，制得的石墨烯電鏡載網(wǎng)能有效抑制冷凍電鏡制樣中的氣液界面效應(yīng)。該方法簡單易行，且避免了傳統(tǒng)的高分子輔助轉(zhuǎn)移法帶來的污染。基于此，研究團(tuán)隊(duì)實(shí)現(xiàn)了懸空石墨烯電鏡支撐膜的批量制備，其懸空膜完整度高達(dá)99.5%。通過掃描隧道顯微鏡(STM)、冷凍電鏡等表征手段，以及DFT理論計(jì)算，研究團(tuán)隊(duì)確定了硬脂酸分子的自組裝結(jié)構(gòu)：兩個(gè)硬脂酸分子的羧基通過分子間氫鍵連接成環(huán)，形成二聚體后實(shí)現(xiàn)規(guī)則排列。緊接著，研究團(tuán)隊(duì)將GSAMs載網(wǎng)用于冷凍電鏡成像中，發(fā)現(xiàn)GSAMs復(fù)合膜提供了與蛋白分子相互作用的界面，因此該復(fù)合結(jié)構(gòu)對(duì)蛋白具有“錨定”作用，在負(fù)載時(shí)能顯著降低蛋白吸附在氣液界面的比例。同時(shí)，研究團(tuán)隊(duì)將GSAMs與冷凍電鏡成像常用的表面活性劑添加劑進(jìn)行對(duì)比，發(fā)現(xiàn)GSAMs能更好地提高蛋白分子在冰層中的濃度及取向，有利于高效率、高分辨的三維重構(gòu)。綜合以上優(yōu)勢，研究團(tuán)隊(duì)利用GSAMs載網(wǎng)對(duì)多種不同尺度的蛋白進(jìn)行了冷凍電鏡的高分辨結(jié)構(gòu)解析，包括2.6?分辨率的鏈霉親和素(streptavidin, 52kDa)、3.3?分辨率的人體血管緊張素轉(zhuǎn)換酶2-新冠病毒刺突蛋白受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域復(fù)合體(ACE2-RBD, 100kDa)以及2.0?分辨率的20S蛋白酶體(20S proteasome, 690kDa)等。
 

圖3 GSAMs超結(jié)構(gòu)的制備與表征
 

　　圖4 GSAMs復(fù)合膜顯著提高冷凍電鏡成像質(zhì)量，成功解析多種蛋白的高分辨三維結(jié)構(gòu)
 

　　該研究工作中(Nature Commun.  2024, 15 , 7300)，彭海琳、王宏偉、清華大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院博士劉楠以及深圳理工大學(xué)博士趙超為論文共同通訊作者，北京大學(xué)化學(xué)學(xué)院博雅博士后鄭黎明、清華大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院博士生徐潔、中國航天科技創(chuàng)新研究院博士王偉華與北京大學(xué)化學(xué)學(xué)院博士生高嘯寅為論文共同第一作者。北京大學(xué)化學(xué)學(xué)院劉忠范教授團(tuán)隊(duì)、吳凱教授/周雄研究員團(tuán)隊(duì)等為重要合作者。
 

　　該工作得到國家自然科學(xué)基金、國家重大科學(xué)研究計(jì)劃、北京分子科學(xué)國家研究中心、北京生物結(jié)構(gòu)前沿研究中心、清華-北大生命科學(xué)聯(lián)合中心、中國博士后科學(xué)基金、騰訊基金會(huì)等資助，并得到了北京石墨烯研究院、水木未來科技有限公司、北京大學(xué)化學(xué)與分子工程學(xué)院的分子材料與納米加工實(shí)驗(yàn)室(MMNL)儀器平臺(tái)的支持。