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PCR反應DNA 復制所需的基本要素2023/02/27

聚合酶鏈式反應（PolymeraseChainReaction，PCR）是一項利用DNA雙鏈復制原理，在生物體外復制特定DNA片段的的核酸合成技術。可在短時間內(nèi)大量擴增目的DNA片段，而不必依賴大腸桿菌或酵母菌等生物體。DNA的半保留復制是生物進化和傳代的重要途徑。雙鏈DNA在多種酶的作用下可以變性解旋成單鏈，在DNA聚合酶的參與下，根據(jù)堿基互補配對原則復制成同樣的兩分子拷貝。在實驗中發(fā)現(xiàn)，DNA在高溫時也可以發(fā)生變性解鏈，當溫度降低后又可以復性成為雙鏈。因此，通過溫度變化控制DNA的變性和復性

防止ELISA污染幾種方法2023/02/20

防止ELISA污染幾種方法：污染會在ELISA數(shù)據(jù)的下游分析中造成許多問題，如孔與孔之間的高差異、高背景值和弱或低信號強度。有幾種方法可以防止污染：1.在一個干凈的環(huán)境中工作；2.通過去離子或蒸餾對所有的水進行消毒；3.每次轉(zhuǎn)移時使用新的和干凈的試劑；4.在兩個樣品之間使用新的移液器吸頭；5.準備和應用樣品時要小心，避免濺到或交叉污染；6.如果使用自動化，確保系統(tǒng)被清潔，試劑供應經(jīng)常更新；7.只去除試劑需要的部分，避免將其倒回庫存瓶中，因為這可能會引入污染物。

熒光定量試劑盒基本反應步驟2023/02/14

PCR由變性--退火--延伸三個基本反應步驟構成：1、模板DNA的變性：模板DNA經(jīng)加熱至94℃左右一定時間后，使模板DNA雙鏈或經(jīng)PCR擴增形成的雙鏈DNA解離，使之成為單鏈，以便它與引物結合，為下輪反應做準備；2、模板DNA與引物的退火(復性)：模板DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后，溫度降至55℃左右，引物與模板DNA單鏈的互補序列配對結合；3、引物的延伸：DNA模板--引物結合物在Taq酶的作用下，以dNTP為反應原料，靶序列為模板，按堿基配對與半保留復制原理，合成一條新的與模板DNA鏈互補的半保

ELISA試劑盒蔗糖封閉的原理2023/02/10

ELISA的試劑盒說明上寫封閉液用蔗糖溶液，一般是用BSA或酪蛋白的蛋白分子封閉空白位點，蔗糖封閉的原理：1、ELISA實驗中，蔗糖本身沒有封閉作用;2、封閉液一般是BSA、酪蛋白等或者是Tween等。3、加蔗糖的主要目的是保護ELISA板子吸附(包被)的蛋白，起到“保護劑”的作用。4、蔗糖溶液一般在ELISA板子經(jīng)過BSA封閉后加，當然也有將蔗糖加到封閉液中同時進行處理;那一種更好需要你實驗后來驗證。但多數(shù)選擇前者。封閉劑還可用5%的脫脂乳(市售即可)，0.4%的明膠，但是實驗表明前者比較好，

大鼠表皮黑色素細胞培養(yǎng)操作2023/01/29

大鼠表皮黑色素細胞培養(yǎng)操作:1、復蘇細胞：將含有1mL細胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍，加入4mL培養(yǎng)基混合均勻。在1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液，補加1-2mL培養(yǎng)基后吹勻。然后將所有細胞懸液加入培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過夜（或?qū)⒓毎麘乙杭尤?0cm皿中，加入約8ml培養(yǎng)基，培養(yǎng)過夜）。第二天換液并檢查細胞密度。2、細胞傳代：如果細胞密度達80%-90%，即可進行傳代培養(yǎng)。1）.棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤洗細胞1-2次。2）.加1ml消化液（0.25%Trypsin-0

ELISA試劑盒洗滌要點2023/01/16

洗滌是ELISA不同于均相免疫學檢測技術的一大特征，洗滌在整個ELISA反應過程中雖不是一個反應步驟，卻非常關鍵。其目的是去除反應體系中與反應無關的成分，包括未結合的酶結合物以及反應過程中非特異性吸附于固相載體的干擾物質(zhì)。洗滌液通常為含有一定濃度Tween20的緩沖液，Tween20是一種非離子去垢劑，既含親水基團，又含疏水基團，在洗滌中的作用機制是借助其疏水基團與經(jīng)疏水性相互作用被動吸附于聚苯乙烯固相上蛋白分子的疏水基團形成疏水鍵，從而削弱蛋白分子與固相的吸附。同時在其親水基團與液相中水分子的

細胞系研究應用領域2023/01/09

細胞系指原代細胞培養(yǎng)物經(jīng)首ci傳代成功后所繁殖的細胞群體，也指可長期連續(xù)傳代的培養(yǎng)細胞?，F(xiàn)在細胞系廣泛的應用于科學研究和藥物生產(chǎn)，用途包括：1、科學研究：藥物研究開發(fā)與基礎研究藥物研究與開發(fā)：（1）新藥篩選：如化學合成藥物藥效研究、中藥有效成分篩選與鑒定等。（2）疫苗研究與開發(fā)：如病毒性疫苗的研究與開發(fā)（肝炎病毒疫苗、艾滋病疫苗等）、腫瘤疫苗(多肽疫苗)等。（3）基因工程藥物研究與開發(fā)：如干擾素研究與開發(fā)，細胞生長因子研究與開發(fā)等。（4）細胞工程藥物研究與開發(fā)：生物活性多肽研究與開發(fā)，人參皂甙等

ELISA避免污染方法2023/01/05

ELISA避免污染方法：污染會在ELISA數(shù)據(jù)的下游分析中造成許多問題，如孔與孔之間的高差異、高背景值和弱或低信號強度。有幾種方法可以防止污染：1.在一個干凈的環(huán)境中工作；2.通過去離子或蒸餾對所有的水進行消毒；3.每次轉(zhuǎn)移時使用新的和干凈的試劑；4.在兩個樣品之間使用新的移液器吸頭；5.準備和應用樣品時要小心，避免濺到或交叉污染；6.如果使用自動化，確保系統(tǒng)被清潔，試劑供應經(jīng)常更新；7.只去除試劑需要的部分，避免將其倒回庫存瓶中，因為這可能會引入污染物。

小鼠elisa檢測試劑盒操作步驟2022/12/19

小鼠elisa檢測試劑盒操作步驟：1.取出試劑盒，室溫（20-25℃）放置30分鐘。2.分組：取出96孔板，根據(jù)待測樣品數(shù)量加上標準品的數(shù)量決定所需的板條數(shù)，把剩余的板條繼續(xù)冷藏處理。分別設標準品組（6個濃度）、空白孔、待測樣品組。注：為減少實驗誤差，保證準確性，建議設置復孔。3.加樣：依照標準品的順序分別加入50ul的標準品溶液于空白微孔中；空白對照孔加入50ul的蒸餾水；其余微孔中加入50ul的待測樣本。4.加酶標溶液：標準品組、待測樣本組各孔中加入100ul的酶標溶液（空白對照孔除外）。5

小鼠血清/血漿樣本的制備2022/12/12

血清和血漿均是不含細胞（包括血小板）等有形成分的血液液體部分，其主要區(qū)別是血清不含凝血因zi和血小板，血漿則含有凝血因zi，它們的制備方法如下：1、血清的制備：獲得的血液不能抗凝，盛于離心管或可以離心的器皿中，靜置或置于37℃環(huán)境中促其凝固，待血液凝固后，將其平衡并離心（一般為3000rpm，離心5～10min），得到的上清液即為血清，可小心將上清吸出（注意切勿吸出細胞成分），分裝備用。2、血漿的制備：在盛血的容器中先加人一定比例的抗凝劑（抗凝劑：血液=1：9，將血液加到一定量后顛倒混勻，離心（

特異性RNA酶抑制劑的廣泛應用2022/11/23

下面介紹３種廣泛應用的特異性RNA酶抑制劑。1、RNA酶的蛋白質(zhì)抑制劑是從人胎盤分離的一種蛋白質(zhì)可與多種RNA酶緊密結合（KI≈3x1010）形成非共價結合的等摩爾復合物，使RNA酶失活。此蛋白質(zhì)體內(nèi)可能是血管生成素的抑制劑，血管生成素是氨基酸序列和推測的三級結構與胰RNA酶類似的一種血管生成因子，幾個廠家以不同的商品名出售這種抑制劑，該蛋白質(zhì)應置于含5mmol/L二硫蘇糖醇（DTT）的50％甘油中，貯存于－20℃。抑制劑制品凍融數(shù)次后或放置在氧化條件下即應棄之不用，因為上述處理會使蛋白質(zhì)變性從

PCR反應循環(huán)參數(shù)分析2022/11/14

PCR反應循環(huán)次數(shù)，一般為25～30次。循環(huán)數(shù)決定PCR擴增的產(chǎn)量。模板初始濃度低，可增加循環(huán)數(shù)以便達到有效的擴增量。但循環(huán)數(shù)并不是可以無限增加的。一般循環(huán)數(shù)為30個左右，循環(huán)數(shù)超過30個以后，DNA聚合酶活性逐漸達到飽和，產(chǎn)物的量不再隨循環(huán)數(shù)的增加而增加，出現(xiàn)了所謂的“平臺期"。循環(huán)參數(shù):1.預變性模板DNA*變性與PCR酶的*激活對PCR能否成功至關重要，建議加熱時間參考試劑說明書，一般未修飾的Taq酶激活時間為兩分鐘。2.變性步驟循環(huán)中一般95℃，30秒足以使各種靶DNA序列*變性，可能的

HRP常見的底物2022/11/07

HRP底物范圍較廣，包括二氨基聯(lián)苯胺(DAB)、氯萘酚和氨乙基咔唑等。一、二氨基聯(lián)苯胺／金屬鹽DAB是辣根過氧化物酶最敏感、常用的底物。它產(chǎn)生強烈的棕色產(chǎn)物，在水和醇中不溶解。多數(shù)情況下，推薦在DAB中加入不同的金屬離子。當加入金屬鹽如鈷、鎳至底物液中，辣根過氧化物酶可以更加敏感。此類反應產(chǎn)物呈暗藍灰色至黑色，且在水及醇中穩(wěn)定。DAB／金屬鹽染色應用的組織染色范圍較廣。1.需要的溶液和特殊設備DAB，0.05mol／LTris緩沖液(pH7.6),0.3％(W/V)氯化鎳/水貯存液,30％過氧化

小鼠ELISA試劑盒雙抗體夾心法操作方法2022/10/31

小鼠ELISA試劑盒雙抗體夾心法操作方法：1.包被:用0.05MPH9.牰碳酸鹽包被緩沖液將抗體稀釋至蛋白質(zhì)含量為1~10μg/ml。在每個聚苯乙烯板的反應孔中加0.1ml，4℃過夜。次日，棄去孔內(nèi)溶液，用洗滌緩沖液洗3次，每次3分鐘。(簡稱洗滌，下同)。2.加樣:加一定稀釋的待檢樣品0.1ml于上述已包被之反應孔中，置37℃孵育1小時。然后洗滌。(同時做空白孔，陰性對照孔及陽性對照孔)。3.加酶標抗體:于各反應孔中，加入新鮮稀釋的酶標抗體(經(jīng)滴定后的稀釋度)0.1ml。37℃孵育0.5~1小時

ELISA實驗雙抗體夾心法操作步驟2022/10/24

用于檢測未知抗原的雙抗體夾心法:1.包被：用0.05MPH9.牰碳酸鹽包被緩沖液將抗體稀釋至蛋白質(zhì)含量為1～10μg/ml。在每個聚苯乙烯板的反應孔中加0.1ml，4℃過夜。次日，棄去孔內(nèi)溶液，用洗滌緩沖液洗3次，每次3分鐘。(簡稱洗滌，下同)。2.加樣：加一定稀釋的待檢樣品0.1ml于上述已包被之反應孔中，置37℃孵育1小時。然后洗滌。(同時做空白孔，陰性對照孔及陽性對照孔)。3.加酶標抗體：于各反應孔中，加入新鮮稀釋的酶標抗體(經(jīng)滴定后的稀釋度)0.1ml。37℃孵育0.5～1小時，洗滌。4

解說PCR反應中的主要成份引物2022/10/17

PCR反應產(chǎn)物的特異性由一對上下游引物所決定。引物的好壞往往是PCR成敗的關鍵。引物設計和選擇目的DNA序列區(qū)域時可遵循下列原則：1、引物長度約為16-30bp，太短會降低退火溫度影響引物與模板配對，從而使非特異性增高。太長則比較浪費，且難以合成。2、引物中G+C含量通常為40%-60%，可按下式粗略估計引物的解鏈溫度Tm＝4(G+C)+2(A+T)。3、四種堿基應隨機分布，在3'端不存在連續(xù)3個G或C，因這樣易導致錯誤引發(fā)。4、引物3'端最好與目的序列閱讀框架中密碼子第一或第二位核苷酸對應，以

組織蛋白酶A抗體鑒定2022/10/10

組織蛋白酶A抗體鑒定：1、抗體的效價鑒定：不管是用于診斷還是用于治療,制備抗體的目的都是要求較高效價。不同的抗原制備的抗體,要求的效價不一。鑒定效價的方法很多,包括有試管凝集反應,瓊脂擴散試驗,酶聯(lián)免疫吸附試驗等。常用的抗原所制備的抗體一般都有約成的鑒定效價的方法,以資比較。如制備抗抗體的效價,一般就采用瓊脂擴散試驗來鑒定。2、抗體的特異性鑒定：抗體的特異性是指與相應抗原或近似抗原物質(zhì)的識別能力?？贵w的特異性高,它的識別能力就強。衡量特異性通常以交叉反應率來表示。交叉反應率可用競爭抑制試驗測定。

免疫細胞分離技術 ?2022/10/05

免疫細胞分離技術1、淋巴細胞的分離取肝素抗凝血1ml加Hanks液1：1稀釋后，沿管壁徐徐滴流疊加盛有2ml淋巴細胞分離液的試管內(nèi)（注意勿與分離液混合，然后2000r/min水平離心20min，管內(nèi)分為4層，自上而下依次為血漿，單個核細胞，顆粒白細胞、紅細胞。用毛細管伸至單個核細胞層中（位于細胞分離液與血漿的界面上），沿管壁輕輕吸出全部細胞。然后用Hanks液洗兩次，每次2000r/min離心10min，最后用RPMIl640培養(yǎng)液將細胞配成2×106/m1的細胞懸液備用。2、T細胞及B細胞的分

今日快訊：菌種的培養(yǎng)2022/09/26

菌種的培養(yǎng)：1、菌種是指食用菌菌絲體及其生長基質(zhì)組成的繁殖材料。菌種分為母種（一級種）、原種（二級種）和栽培種（三級種）三級。工業(yè)發(fā)酵的有用菌種，其篩選步驟包括菌種分離、初篩和復篩。2、挑選具有某種能力的有用菌種，也稱種子制備，是指菌種在一定條件下，經(jīng)過擴大培養(yǎng)成為具有一定數(shù)量和質(zhì)量的純生產(chǎn)菌種的制備過程。以作接入發(fā)酵罐中進一步擴大菌體量及合成產(chǎn)物之用。3、種子制備包括孢子制備和菌絲體制備菌種制備。4、保存在沙土管或冷凍管中的生產(chǎn)菌種，用無菌手續(xù)挑取少許，接入瓊脂斜面培養(yǎng)基上，在25℃（或較高溫

PCR反應溫度控制設置2022/09/19

在PCR自動熱循環(huán)中，關鍵的因素是變性與退火的溫度。如操作范例所示，其變性、退火、延伸的條件是：94℃60s,37℃60s,72℃120s，共25～30個循環(huán)，擴增片段500bp。在這里，每一步的時間應從反應混合液達到所要求的溫度后開始計算。在自動熱循環(huán)儀內(nèi)由混合液原溫度變至所要求溫度的時間需要30～60s，這一遲滯時間的長短取決于幾個因素，包括反應管類型、壁厚、反應混合液體積、熱源(水浴或加熱塊)以及兩步驟間的溫度差，在設置熱循環(huán)時應充分給以重視和考慮，對每一儀器均應進行實測。關于熱循環(huán)時間的