反硝化細(xì)菌的篩選及培養(yǎng)方法！

反硝化細(xì)菌的篩選及培養(yǎng)方法！

反硝化細(xì)菌是一種能引起反硝化作用的細(xì)菌。多為異養(yǎng)、兼性厭氧細(xì)菌，如反硝化桿菌、斯氏桿菌、螢氣極毛桿菌等。反硝化細(xì)菌 ( denitrifying  bacteria )通過誘導(dǎo)產(chǎn)生硝酸還原酶和亞硝酸還原酶對硝酸鹽和亞硝酸鹽進行還原。不同反硝化細(xì)菌的反硝化作用能力不同，生長條件也存在很大差異。作者從玉溪紅塔集團技術(shù)中心生理生化實驗室篩選出的45株具有反硝化作用的細(xì)菌菌株中， 進一步篩選具有較強反硝化作用能力的菌株，并對目的菌株的適培養(yǎng)基、生長溫度及好氣性進行測定 ，為反硝化細(xì)菌的利用提供依據(jù)。至于該菌的篩選及培養(yǎng)條件如下：

一、材料

菌株及來源

反硝化細(xì)菌菌株： B11，B15，B20，B27，B28，B67，B88，B112，B115，B118，B121，B132，B135，B223，B224，B226，B237，B241，B246，B248，B249，B260，B289，B290，B291，B292，B294，B295，B296，B297，B298，B299，B300，B310，B311，B315，B316，B318，B319，B320，B322，B323，B329，B330，B419。

培養(yǎng)基及制備

1.Giltay培養(yǎng)基

A溶液：KNO3 1.0g ，天冬酰胺1.0g ，1％BTB酒精溶液5mL ，蒸餾水500mL 。

B溶液：檸檬酸鈉8.5g ，MgSO4· 7 H 2O 1.0g ，F(xiàn) e Cl3·6 H 2 O 0.05g ，KH 2 PO4  1.0g ，CaC12· 2.H 2O 0.2g ，蒸餾水500mL 。

混合A、 B兩溶液調(diào)節(jié)pH值為7.0～7.2，分別裝入250mL三角瓶，每瓶150mL，滅菌備用。

2.待篩培養(yǎng)基

硝酸鹽培養(yǎng)基：牛肉浸膏3g ，蛋白胨5g ，KNO3 ( NaNO3 ) 1g，蒸餾水1000mL。

反硝化細(xì)菌培養(yǎng)基：KNO32g ， MgSO4·7 H2O 0.2g ，K2HPO4  0.5g ，酒石酸鉀鈉20g ，蒸餾水1000mL 。

3.Y B培養(yǎng)基。

調(diào)節(jié)待篩培養(yǎng)基和YB培養(yǎng)基pH為7.2，分別裝入250mL三角瓶，每瓶150mL，滅菌備用。

4.斜面培養(yǎng)基

牛肉浸膏蛋白胨培養(yǎng)基。

儀器與器材

自動化學(xué)分析儀，CO2培養(yǎng)箱，血球計數(shù)板，搖床。

二、方法

菌株反硝化作用能力的測定

1.產(chǎn)氣特性測定

參考Giltay方法測定反硝化作用菌株的產(chǎn)氣特性：

將制備的Giltay液體培養(yǎng)基，加入大試管( 20mm×200mm)中，把纏有細(xì)線的小試管 ( 12mm×75mm ) 倒立放入大試管中，將小試管中的氣體排凈，塞住大試管，留部分細(xì)線在大試管外，便于小試管的提升和降落，滅菌備用。

用 Giltay液體培養(yǎng)基2mL洗下活化后的菌株， 轉(zhuǎn)入盛有小試管和Giltay液體培養(yǎng)基的大試管中，將小試管提升一段距離，以便接收氣體，接種時注意不要使小試管內(nèi)進入氣體。每個菌株接4支試管，30℃恒溫培養(yǎng)10～14d，觀察結(jié)果。重復(fù)3次。

2.硝酸鹽降解能力的測定

將產(chǎn)氣試管內(nèi)的培養(yǎng)基濾紙過濾，取濾液，用蒸餾水稀釋100倍 ，以自動化學(xué)分析儀檢測培養(yǎng)基中的含氮量，測定菌株的反硝化作用能力，重復(fù)3次。以滅菌后的培養(yǎng)基作為對照。

3.菌株適宜培養(yǎng)基及好氣性測定

將篩選出的菌株在斜面上30℃培養(yǎng)1d后，用10mL無菌水洗下，振蕩混勻。分別轉(zhuǎn)接1mL洗下的菌液于滅菌的硝酸鹽培養(yǎng)基、反硝化細(xì)菌選培養(yǎng)基和YB培養(yǎng)基中。每個處理都分別在搖床和CO2培養(yǎng)箱( CO2濃度為20％) 中，30℃振蕩培養(yǎng)1d。稀釋平板法測定篩選菌株的適培養(yǎng)基及好氣性。重復(fù)3次。

4.生長溫度的測定

設(shè)20℃、25℃、30℃、35℃、40℃等5種溫度梯度，30℃YB培養(yǎng)基培養(yǎng)1d ，稀釋平板法測定菌株生長的適溫度。

5.菌體濃度的測定

設(shè)18、21、24、27、30、33 h等7個時間梯度，30℃YB培養(yǎng)基培養(yǎng)，用血球計數(shù)法測定所篩菌株在適生長條件下菌體的濃度。

三、結(jié)果與分析

菌株反硝化作用強度的篩選

1.產(chǎn)氣測定

在接種B88、B237菌株的試管內(nèi)，2d后培養(yǎng)基開始變藍(lán)，并有少量氣體產(chǎn)生，滯留在小試管中；3d后培養(yǎng)基由綠色變?yōu)樗{(lán)色，小試管內(nèi)的氣體明顯增多；接種3～4d后，產(chǎn)氣的速度，氣體量多，以后幾天則看不出氣體量的增加。接種其他菌株的試管內(nèi)，培養(yǎng)基顏色由上向下逐漸變藍(lán) ，但不產(chǎn)氣。

利用Giltay培養(yǎng)基法篩選菌株，試管中的培養(yǎng)基由于反硝化細(xì)菌硝酸還原酶的作用，硝酸鹽還原為亞硝酸鹽，使培養(yǎng)基呈堿性，培養(yǎng)基顏色由綠色變?yōu)樗{(lán)色。反硝化作用較強的菌株通過亞硝酸還原酶的作用，亞硝酸鹽進一步還原成*或氮氣， 滯留在小試管中。在45個供試菌株中，B88和B237菌株能夠較好地降解培養(yǎng)基中的硝酸鹽和亞硝酸鹽，產(chǎn)氣早，速度快，3～4d產(chǎn)氣達(dá)到高峰，表明其反硝化作用較強。其他菌株雖然也都能將硝酸鹽還原成亞硝酸鹽，但不能進一步還原亞硝酸鹽，反硝化作用較弱。

2.菌株降解硝酸鹽特性的測定

在接種B88 、B237的培養(yǎng)基中，含氮量明顯降低，表明B88 、 B237菌株具有較強的反硝化作用，能夠有效降解培養(yǎng)基中的硝酸鹽。

3.生長溫度測定

溫度對B88、B237菌株的生長速度有顯著影響，在好氣條件下，用YB培養(yǎng)基振蕩培養(yǎng)，菌株在20℃～40℃之間均能較好地生長，30℃左右為適生長溫度。

4.生長濃度的測定

反硝化細(xì)菌經(jīng)過緩慢增*和指數(shù)增*后，由于營養(yǎng)的消耗和細(xì)菌之間的抑制作用， 菌體衰老、 消解，細(xì)菌濃度逐漸降低。B88菌株在適培養(yǎng)條件下生長濃度為6.1×10個·mL-1，B237菌株在適培養(yǎng)條件下生長濃度為1.54×10^8個· mL-1。

5.培養(yǎng)基及好氣性測

由于反硝化細(xì)菌是在厭氧或微厭氧的條件下通過硝酸鹽誘導(dǎo)產(chǎn)生的硝酸還原酶和亞硝酸還原酶進行反硝化作用，因此，大多數(shù)研究人員在實驗室培養(yǎng)反硝化細(xì)菌時，多在微厭氧條件下進行。但本試驗結(jié)果表明，不管有無硝酸鹽的誘導(dǎo)，B88、B237菌株的快速生長是好氣性的，生長受氧氣供應(yīng)量的限制，CO2含量(20％)的提高，對菌株的生長具有較強抑制作用； 在不同培養(yǎng)基上，其生長速度差別較大；在反硝化細(xì)菌培養(yǎng)基上生長速度反而慢 ， 而在YB培養(yǎng)基中的 生長速度快。

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