酵母質(zhì)粒提取的操作方法和步驟！

酵母質(zhì)粒提取的操作方法和步驟！

酵母質(zhì)粒提取可以用試劑盒提取，也可以直接用裂壁酶處理后采用堿裂解法提取質(zhì)粒。下面我們就用百歐博偉生物酵母質(zhì)粒提取試劑盒為例講解酵母質(zhì)粒提取方法和步驟。

⒈接種單菌落(待檢測酵母細胞)于25mLYNB(補加氨基酸 營養(yǎng)物)培養(yǎng)基中，30℃振蕩培養(yǎng)隔夜。

⒉第二天取一滴菌液于進行顯微鏡下觀察,目鏡用16,物鏡用40倍觀察細胞壁破碎前的狀態(tài),其成桿狀,流動性比較下.

⒊取10ml的培養(yǎng)酵母菌液,5000g離心3min,棄上清液.加入5ml的1倍TE懸浮.

⒋將懸浮液倒入高壓破壁儀的樣品管中,利用高壓破碎機進行破碎細胞壁,壓力加到20Mpa,停留15s,降壓,反復來回壓3次.取出細胞液,取一滴于顯微鏡下觀察,如果細胞呈不規(guī)則的球狀時,而且其流動性 比較大,說明其細胞壁已經(jīng)破碎成為原生質(zhì)體.

⒌取2個EP管,每管加入1.5ml上述的細胞液,12000g離心5min,收集原生質(zhì)體.棄取上清液,每管加入300ul10%的SDS溶液,混勻冰浴5min,進行破原生質(zhì)體.

⒍然后加入150ul的tris飽和酚,和150ul的鹵仿異戊醇混合液(鹵仿:異戊醇=24:1),混勻,12000g,離心10min.

⒎將水相移到另一EP管中,加入等體積的鹵仿異戊醇混合液(鹵仿:異戊醇=24:1), 混勻,12000g,離心10min.

⒏將水相移到另一EP管中,加入1/10體積的3M KAC溶液和2倍體積的無水乙醇,放入-20℃冰箱中

⒐1h,12000g離心10min,倒出乙醇,等干燥后加入1ml的70%的無水乙醇,混勻,12000g,離心10min.

⒑棄去乙醇,等室溫干燥后,每管加入20ul的TE溶液(如要去處RNA酶,加入1ul的100mg/ml濃度的RNA酶),放入-20℃冰箱即可.

⒒跑電泳進行檢測是否從酵母菌中提出質(zhì)粒了。

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